栉孔扇贝Cf-dmrt4-like基因的克隆、序列特征及表达分析

DMRT家族是一类转录因子,在性别决定与分化、器官形成等早期胚胎发育中起重要的作用。本研究采用简并PCR扩增和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从栉孔扇贝(Chlamys farreri)精巢中克隆得到1个全长为2312bp的dmrtcDNA序列,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)1110bp,编码369个氨基酸,具有dmrt基因家族共有的DM保守结构域。同源比对和系统进化分析结果显示,其为Cf-dmrt4-like基因。半定量RT-PCR结果显示,该基因从受精卵至匍匐幼虫各发育时期均有表达,卵裂期表达量较高;在雄性成体的鳃和精巢以及雌性成体的外套膜、鳃、肾和闭壳肌中表达,但卵巢中未见表达。qRT-PCR检测不同发育时期的精卵巢,以成熟期精巢表达量最高。由此推测,栉孔扇贝Cf-dmrt4-like基因参与个体的早期发育,并在两性成体中发挥着不同的作用。     

驯鹿生长素Ghrelin cDNA的克隆

从驯鹿皱胃组织中提取总RNA,根据已发表的驯鹿生长素Ghrelin基因序列设计并合成引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增,获得了300 bp的片段,重组到pBlueselect T载体,经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定分析,确认PCR产物为Ghrelin cDNA,为进一步研究Chrelin在驯鹿体内的分布及营养因素等对其基因表达的影响奠定基础。     

东方蜜蜂卵黄原蛋白基因cDNA克隆及其基本生物信息学特征

卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)基因在蜜蜂的卵巢发育、胚胎营养、劳动分工、行为调控、气候适应、寿命延长等方面起着重要作用,但东方蜜蜂中该基因的基础数据却鲜有报道。本研究对东方蜜蜂Vg基因的cDNA全长序列进行了克隆、测序和基本的生物信息学分析,结果表明:东方蜜蜂Vg基因cDNA全长序列为5313bp,提交到Gen Bank的登录号为KP119837,该基因共编码1770个氨基酸,其cDNA和所编码的氨基酸序列与意大利蜜蜂的同源性分别为93%和89%,其保守区序列占全序列的63%。基于Vg基因对蜜蜂属内序列已知的4种蜜蜂构建的系统发育树显示:东方蜜蜂与意大利蜜蜂的亲缘关系最近,与大蜜蜂的亲缘关系稍远,与小蜜蜂的亲缘关系最远。本论文为进一步研究东方蜜蜂Vg基因的功能奠定了基础。     

Molecular Cloning and Characterization of a Novel Gene Involved in Fatty Acid Synthesis in Brassica napus L.

Based on the sequence of a novel expressed sequence tag (EST), the full-length cDNA of 1 017 nucleotides was cloned from Brassica napus cv. Xiangyou 15 through rapid amplification of cDNA ends (RACE). The gene was designated as Bnhol34 (HQ585980), encoding a protein of 338 amino acids. BLAST analysis showed no high degree of sequence identity to any known gene. The calculated molecular weight of the Bnhol34 protein was 36.23 kDa, and the theoretical isoelectric point was 8.74. The Bnhol34 was also cloned from a high oleic acid mutant 854-1 through homologous cloning. There was no difference between the two Bnhol34 genes. Bnhol34 was localized in a tissue-specific manner in B. napus, and its expression level was about eight-fold greater in Xiangyou 15 seeds than in 854-1. The promoter region sequences of Bnhol34 were then isolated from Xiangyou 15 and 854-1, and a 93-bp deletion was found to occur in the Bnhol34 promoter region of 854-1. Three abscisic acid-responsive cis-elements (ABRE) were identified in the promoter region of Xiangyou 15. Real-time PCR analyses revealed that exogenous abscisic acid increased Bnhol34 expression by about four-fold in Xiangyou 15 seeds, yet did not change Bnhol34 expression in 854-1. It appeared that Bnhol34 might be abscisic acid insensitive in 854-1.     

番木瓜环斑病毒检测新技术的建立及其在病毒——原生质体体系探索中的初步应用

为了有助于全面了解和评价番木瓜完整植株对番木瓜环斑病毒(PRV)的抗、感病性机制,建立单细胞侵染模型是一个重要途径。本研究首次建立了PRV-番木瓜原生质体实验体系;建立了检测 PRV的间接Dot-ELISA和检测PRV-RNA的 cDNA分子探针的方法和技术,并利用这2个检测技术对PRV在番木瓜原生质体中的行为动态进行了初步探索。     

应用cDNA微阵列芯片技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因的研究

采用cDNA微阵列芯片技术，从所构建的猪蛔虫雌、雄成虫cDNA消减文库分别挑取1044和1119个克隆，PCR扩增其插入片段，经纯化后点样于预先处理好的基片上（双点杂交），制备成cDNA微阵列芯片。将分别标记荧光素Cy3-dUTP和Cy5-dUTP的雌虫和雄虫cDNA探针，与制备好的cDNA芯片杂交（平行进行反标杂交试验）。根据每个点杂交后的Ratio值，筛选出双点杂交和正反标中都同时具有表达差异的基因克隆共1559个。将表达差异最明显的前831个克隆进行测序，获得720个有效序列，经生物信息学分析发现，雄虫特异表达的主要精于蛋白和雌虫特异表达的卵巢信息蛋白的基因序列多数与新杆属线虫存在同源性，有31个可能是新的ESTs。性别差异表达基因及其相关生物信息的获得为下一步研究基因功能奠定了基础。     

猪细胞因子cDNA表达文库的构建及其基因的克隆鉴定

为克隆和研究猪细胞因子及相关基因,应用建库试剂盒成功构建了猪细胞因子cDNA表达文库。采取健康猪外周血及淋巴结,分离单个核细胞,经LPS PHA联合刺激不同时间后,提取总RNA。将各组样品混合,分离纯化mRNA。反转录合成cDNA第一链和第二链,与EcoRI和HindⅢ接头连接。酶切和过柱分级分离后,与λScreen载体连接,经体外包装转染E.coliER1647宿主菌,进行文库容量测定和扩增。以扩增文库的DNA为模板,利用已知基因引物克隆猪IL-2和IL-4的cDNA并进行测序。结果表明,成功构建了猪细胞因子cDNA文库,文库原始库容量为8×105,插入片段在300~2 000 bp,扩增得到特定的IL-2和IL-4基因,说明文库质量高、代表性强,为进一步从文库中筛选未知细胞因子及相关基因提供了有效的工具。     

地高辛标记cDNA探针检测苹果茎痘病毒

 Partial sequence(314 bp) of ASPV was cloned and used as a probe labelled with digoxigenin-11dUTP. The total RNA extracted from samples with Apple stem pitting virus and a series of dilutions of plasmid with ASPV-cDNA were detected by dot blot hybridization. The results showed that the probe was sensitive and specific. The probe couldn't hybridize with total RNA of Apple stem grooving virus, Apple mosaic virus and Apple chlorotic leaf spot virus samples as well as negative control, only hybridized with that extracted from dormant shoot infected with ASPV. The sensitivity for detection of plasmid contained ASPV-cDNA was 1.64 μg.     

猪CTSD全长cDNA的克隆和表达分析

以人CTSD mRNA全长序列为基序,在db EST库中搜索同源性大于80%、重叠大于40个碱基的猪EST下载经Seqman软件装配后,利用RT-PCR扩增到猪CTSD基因部分cDNA序列,进一步通过RACE技术获得cDNA全长（GenBank登录号为DQ018727）,猪CTSD基因cDNA全长2032 bp包括93 bp 5′UTR区、706 bp 3′UTR区和1 233bp ORF,编码410个氨基酸残基。其编码区与人、鼠、牛、羊CTSD编码区同源性分别为87.9%、78.2%、86.6%和85.0%,其氨基酸序列与人、鼠、牛、羊氨基酸序列同源性分别为86.6%、80.1%、86.0%和84.7%。疏水性分析和信号肽预测发现猪CTSD氨基酸序列存在至少7个疏水性区域,信号肽位点为第1-20个氨基酸残基。在NCBI进行Blast P搜索结果显示猪CTSD氨基酸结构中含有Asn（Asparagine,天门冬酰胺）结构域,与天冬氨酸蛋白酶3D结构同源性高达99.7%,具有真核生物天冬氨酸蛋白酶的典型结构。以猪多组织RNA池为模板,以1026 bp部分cDNA序列作为杂交探针进行Northern杂交,得到一条2000 bp左右特异条带,从而验证了RACE产物为全长cDNA并揭示该基因只有一个转录本。为了研究猪CTSD基因在体内不同组织内表达的特点,采用半定量RT-PCR对CTSD基因在猪10个组织中的表达进行研究,结果表明在10个组织中均有表达,且表达量与-βactin内参接近。