Construction of cDNA Library from Populus euphratica

1 Introduction Populus euphratica is a salt tolerant tree species, which is mainly distributed in the desert regions in northwest China (Wei 1993). Moreover, it is the only large tree species, which can survive and develop into forest in these arid and saline-alkali areas. P. euphratica forest plays a very important role in restraining the expansion of desert, maintaining ecological environment in west China, protecting the biological diversity and raising the local people抯 living standard…     

PCR法克隆紫穗槐4-香豆酸:CoA连接酶全长cDNA

4 香豆酸 :CoA连接酶 (4CL)是木质素生物合成过程中重要的酶 .该文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法直接获得了紫穗槐 4CLAcDNA全长序列 ,避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程 .先用简并PCR得到了 4CLA1片段 ,又据此片段设计反向嵌套引物 ,用RACE方法获得未知的 5′和 3′端序列 .所获得的全长 4CLAcDNA ,编码 5 40个氨基酸 .氨基酸序列同源性分析表明4CLA是典型的 4CL蛋白 ,含有预计的AMP binding位点、催化反应区和保守的Cys .     

桃酵母双杂交cDNA文库的构建及生长素响应因子4互作蛋白的筛选

[目的]为解析桃果实发育成熟的机制,通过构建成熟期前后桃果实的酵母双杂交cDNA文库,筛选生长素响应因子4的互作蛋白,探究生长素响应因子4对桃果实成熟过程的调控作用.[方法]以硬溶质桃(Prunus persica L.)'突围'为材料,提取果皮的总RNA,建立酵母双杂交cDNA文库,采用Mating法筛选生长素响应因子4的互作蛋白.[结果]构建的酵母双杂交cDNA文库的总库容量1.6×107CFU,重组率100％,插入片段平均长度大于1 000 bp.构建诱饵载体pGADT7-PpARF4重组质粒,在桃果实酵母双杂交cDNA文库中筛选互作的靶蛋白,共获得有潜在互作的蛋白26个,主要功能涉及信号转导与胁迫响应、器官的形成、大分子代谢及蛋白合成与修饰因子.[结论]试验建立的酵母双杂交cDNA文库质量较高,完整性较好,为后续筛选果实成熟相关蛋白奠定基础.     

猪skMLCK基因全长cDNA测序及真核表达载体构建

为获得猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skeletal muscle myosin light chain kinase,skMLCK)基因全长cDNA序列,构建猪skMLCK基因的真核表达载体,参考GenBank预测信息并利用Primer Premier 5.0和DNAMAN生物学软件,分2段进行RT-PCR扩增,进行猪skMLCK基因的cDNA全长克隆、测序、拼接、合成,构建猪skMLCK基因的真核表达载体。结果获得了猪skMLCK基因的全长cDNA序列,序列长度为1 851 bp。成功构建了猪skMLCK基因的真核表达载体,重组质粒为pEGFP-N1-skMLCK。猪skMLCK基因全长cDNA的测序和真核表达载体的构建为进一步研究猪skMLCK基因在肌纤维生长发育中的作用奠定基础,为通过基因水平来改善与评价猪肉质性状提出了一个新方向。     

羊驼皮肤中肌钙蛋白C(TnC)基因表达分析

从羊驼皮肤cDNA文库中筛选到TnC基因的克隆,经PCR鉴定并测序得知:克隆大小为722 bp,含有一个完整的开放阅读框(ORF)。并利用生物信息学方法对该基因进行分析,发现该基因编码160个氨基酸,为膜蛋白,部分具有高度同源性,并还有一个EFh家族的保守区域,是该蛋白的功能区域。     

5种鲤形目鱼的β珠蛋白基因cDNA的克隆

根据β珠蛋白的N末端和C末端氨基酸序列的保守性设计20bp长的简并引物，用RT—PCR方法扩增并克隆了鲤(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫(Carassius auratus Linnacus）、泥鳅(Misgurnus anguillicau-datus)、大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)5种鲤形目鱼的β珠蛋白基因cDNA。结果表明，克隆的5种鲤形目鱼的β珠蛋白基因cDNA全长为441bp。但它们所编码的氨基酸序列却有较大的差异，鲤和泥鳅的序列相似性最高，达97．93％，而泥鳅和大鳞副泥鳅的相似性最小，仅有80．68％，其余的相似性介于二者之间。     

鳜hepcidin cDNA的分子克隆及序列分析

Hepcidin是近年来发现的一类具有独特性质的抗菌肽，根据C-enBank中收录的鱼类抗菌肽hepcidin的cDNA序列设计一对简并引物，用RT-PCR方法从鳜（Sinipercachuatsi）肝脏组织中克隆到hepcidin的cDNA，并构建pMD18-T-hep-cidin载体进行序列测定和分析。结果表明，该cDNA长为381bp，其中第20-277位是该基因的开放阅读框（ORF），编码86个氨基酸，形成由信号肽（24个残基）、前肽（42个残基）和成熟肽（20个残基）3部分序列组成的前体肽，与已报道的其他鲈形目鱼类hepcidin相比较，核苷酸序列的同源性为72．2％-92．0％，所推导的成熟肽与包括人类在内的其他生物hepcidin成熟肽的同源性在50％-86．4％，都含有8个保守的cys残基，可形成4个链内二硫键。鳜hepcidin cDNA片段的获得为以后的重组表达奠定了实验基础，也为抗菌肽hepcidin家族找到了新的成员。     

(捺)叶片β-羟脂酰-CoA脱水酶(HCD)基因全长cDNA的分离与表达研究

以(Prunus salicina Lindl.var.cordataJ.Y.Zhangetal)5个不同生长发育时期叶片为试材,根据已构建的5个不同生长发育时期叶片的均一化全长cDNA文库,分离得到了一个羟脂酰-CoA脱水酶(HCD)基因,命名为PsHCD。对PsHCD基因生物信息进行分析,同时利用Real-time PCR检测PsHCD基因在叶片中5个不同生长发育时期的表达量。结果表明:该基因的cDNA开放阅读框编码区为第322个核苷酸到第987个核苷酸,编码221个氨基酸残基,5′UTR长度为321bp,3′UTR长度为156bp。利用TMHMM server软件分析,该基因编码的蛋白质有4个跨膜区域,PSORTⅡPrediction软件分析推测,亚细胞定位于内质网、微体和溶酶体中。实时荧光定量PCR结果表明,PsHCD的表达量随着叶片生长逐渐升高,在展开叶时达到最高峰,在幼叶到成熟叶时处于一种稳定水平,随后降低,老叶表达量最低。     

长白山野生膜荚黄芪cDNA文库的构建与初步鉴定

以长白山区野生膜荚黄芪根和叶为试材,参照TRIzoL说明书提取总RNA,采用SMART技术构建其全长cDNA文库,为分子水平上揭示膜荚黄芪次生代谢调控机制提供充足的基因资源。结果表明:原始文库滴度为4.8×105 cfu/mL,重组率接近99.1%,插入片段大于0.5kb,平均大小1.54kb。所构建的cDNA文库的库容量、克隆效率和全长率满足挖掘膜荚黄芪次生代谢相关基因的要求。