猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank报道的N基因高度保守核苷酸序列,设计并合成一对引物。上下游引物与Gen Bank中登录的153株猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因全长序列匹配度分别是100%和97%。以本实验室分离流行毒株为模板,利用SYBR Green I荧光染料法进行RT-PCR扩增,获得扩增产物构建重组质粒作为阳性对照,建立检测猪流行性腹泻病毒核酸的方法。同一样品进行3次重复试验,变异系数0.9%。通过对临床样品进行检测和测序验证,核酸检测结果中的阳性样品准确率为100%。本研究所建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确等优点,可用于临床PEDV的检测及分子流行病学调查。     

山东省外观健康羊群中检出羊边界病病毒

2014年从山东省外观健康的牛羊采集鼻拭子样品共707份,提取其RNA,用流感病毒特异性引物进行RT-PCR检测。对RT-PCR扩增的阳性产物进行序列测定,意外发现其中1份羊拭子样品含有羊边界病病毒,并且该结果得到其他试验验证。结合我国2012年首次在安徽和江苏两地检出该病毒,以及当前我国羊群流通情况,推测该病毒可能在我国有所存在。该调研结果对分析各类RT-PCR检测的假阳性产生原因,有参考意义。并提示RT-PCR检测结果难以作为疫病或感染病诊断的确切依据。其诊断结果有时需要用荧光探针或测序进行进一步鉴定。     

牛膝多糖对断奶仔猪抗菌肽Protegrin-1 Mrna表达的影响

本文旨在探讨牛膝多糖(ABPS)对断奶仔猪抗菌肽Protegrin-1(PG-1)mRNA表达的影响。试验采用单因子设计,按照日粮处理因素不同,设对照组、抗生素组、0.05%、0.10%和0.15%牛膝多糖组,共5个处理。选用28日龄杜长大仔猪160头,随机分入5个处理,每个处理4个重复,每个重复8头猪(公母各半)。采用半定量RT-PCR法,以18SrRNA为内标,检测PG-1mRNA相对表达量。结果表明:日粮中添加牛膝多糖均不同程度地促进断奶仔猪骨髓抗菌肽PG-1mRNA的表达。与对照组相比,0.05%、0.10%和0.15%牛膝多糖组分别使断奶仔猪PG-1mRNA的相对表达量增加14.9%(P>0.05)、36.4%(P<0.05)和7.3%(P<0.05);与抗生素组相比,其PG-1mRNA的相对表达量分别增加7.8%(P>0.05)、27.9%(P>0.05)和19.4%(P>0.05)。即牛膝多糖能显著促进断奶仔猪骨髓抗菌肽PG-1mRNA表达,且日粮中以0.10%添加量为适宜。     

不同品种绵羊背最长肌PRKAG3和LPL基因的表达差异

选取体重接近的鄂尔多斯细毛羊与昭乌达肉羊各5只,屠宰后取背最长肌检测肌内脂肪含量,用荧光实时定量PCR法检测肌肉PRKAG3和LPL基因mRNA表达水平,分析其与肌内脂肪含量的关系.结果表明,鄂尔多斯细毛羊背最长肌IMF含量显著高于昭乌达肉羊(P＜0.01);鄂尔多斯细毛羊LPL基因mRNA的表达量与鄂尔多斯细毛羊的IMF含量呈负相关(-0.44);PRKAG3基因mRNA的表达量与昭乌达肉羊的IMF含量呈负相关(-0.42),但差异均不显著;鄂尔多斯细毛羊和昭乌达肉羊背最长肌PRKAG3基因mRNA的表达量差异不显著,而鄂尔多斯细毛羊LPL基因mRNA的表达量显著高于昭乌达肉羊(P＜0.01).     

新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为满足新城疫病毒高通量快速检测的需要,针对新城疫病毒M基因序列,通过基因比对分析保守区域,经同源性分析后,设计合成多条引物和探针并对其筛选,建立了一种能够快速检测新城疫病毒的实时荧光RTPCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性进行了评估。结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10~(-4) ng/μL。利用该方法,对480份临床采集的各类家禽咽拭子样品进行检测,共检测出25份阳性,与常规RT-PCR检测方法结果一致,κ值为1(P 0.001)。结果表明,该方法快速、准确,可用于新城疫病毒的快速检测。     

猪肌肉组织LPL基因表达的发育性变化及其与肌内脂肪沉积关系的研究

以40-90 kg 6个体重组的莱芜猪和鲁莱黑猪共72头去势公猪为试验对象(每组6头),采用相对定量RT-PCR方法,以-βactin基因为内标,分析肌肉组织LPL基因表达的发育性变化及其与肌内脂肪沉积的关系。结果表明:莱芜猪与鲁莱黑猪肌肉组织中LPL基因表达的发育性变化趋势基本相似,随体重的增长,莱芜猪50-70kg阶段LPLmRNA表达丰度逐渐下降(P<0.05),80 kg阶段迅速回升出现一个峰值后再次下降;鲁莱黑猪LPLmRNA表达丰度随体重的增加呈缓慢下降趋势,70 kg以后变化不大并维持较低水平,其前期(40-60 kg)与后期(70-90 kg)的表达量差异显著(P<0.05)。总体上莱芜猪肌肉组织LPL基因表达量略高于鲁莱黑猪(P>0.05)。相关分析表明,莱芜猪和鲁莱黑猪肌内脂肪相对含量与肌肉组织LPLmRNA表达的发育性变化分别呈显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)的正相关。研究结果提示:猪肌肉组织LPL是肌内脂肪沉积的重要参与者,其编码基因的表达具有明显的体重发育特征,并对肌内脂肪的沉积具有一定程度影响。     

禽弱毒疫苗中REV低剂量污染检测方法的比较

使用污染有禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的弱毒疫苗是REV感染途径之一,而通常弱毒疫苗中REV的污染剂量较低,难以检测,本研究对不同方法在检测弱毒疫苗中REV低剂量污染进行了比较研究。将定量好的REV以不同剂量分别人为污染一批商品化新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗,提取核酸后分别以TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测、常规RT-PCR检测以及PCR产物结合核酸斑点杂交检测等不同方法进行检测。结果显示常规RTPCR检测仅可检测到10TCID50/羽份的REV污染,而另外两种方法均检测到1TCID50/羽份的低剂量REV污染。将人为污染1TCID50/羽份和2TCID50/羽份REV的NDV弱毒疫苗各接种10只SPF鸡,定期针对REV抗体及其核酸进行检测,结果显示在免疫污染疫苗后7周内REV抗体全部为阴性,而核酸检测均可以检测到一定比例的阳性,提示通过接种SPF鸡检测弱毒疫苗中REV污染时,仅仅通过抗体判定可能会对一些剂量较低的REV污染造成漏检,通过结合对病原的检测有助于降低漏检率。     

蜜蜂畸翅病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立蜜蜂畸翅病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,通过构建蜜蜂畸翅病毒(DWV)RDRP基因部分序列的标准质粒作为模板,进行了标准曲线的建立,并对所建立方法进行了特异性和灵敏度测试。结果表明:所建立的荧光定量RT-PCR扩增效率E=100%,R2=0.999,最低检出量为100个拷贝;该方法仅能检出DWV病毒,而不能检测出蜜蜂黑王台病毒、囊状幼虫病毒,具有很好的特异性。表明已成功建立了特异灵敏的DWV实时荧光定量RT-PCR检测方法。采用所建方法对昆明部分蜂场进行了DWV感染状况调查,结果表明昆明地区东方蜜蜂带毒率为54%,提示DWV病毒在昆明地区东方蜜蜂中存在流行。     

陕西杨凌某蛋鸡场禽戊型肝炎病毒的检测

2014年-2015年陕西杨凌地区部分商品蛋鸡场产蛋量下降了10%~40%,剖检部分鸡只发现肝脏肿大出血。为确诊该疫情的病因,从发病的6个蛋鸡场采集了337份血清和268份粪便,利用间接ELISA和套式RT-PCR分别对血清中的禽戊型肝炎病毒(HEV)抗体和粪便中的禽HEV RNA进行了实验室检测。ELISA检测结果发现,168份血清为禽HEV抗体阳性,阳性率为49.85%;套式RT-PCR检测结果发现,63份粪便为禽HEV RNA基因片段阳性,阳性率为23.51%。基因片段的序列同源性分析发现,杨凌地区的禽HEV分离株与国内的同源性为93.0%~99.2%;进化树分析表明,其与国内其他地区的分离株在同一进化分支上,同属禽HEV基因3型。     

腹水综合征肉鸡肺脏缺氧诱导因子-1α基因克隆及表达研究

从21日龄患腹水综合征（AS）鸡肺脏中提取RNA,根据健康鸡胚心室肌细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因序列（登录号为NM204297）设计引物,采用RT-PCR技术进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收后与载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序.结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与预期大小完全一致,为1 576 bp.序列同源性分析比较表明,该cDNA及其推导的氨基酸序列与鸡胚HIF-1α cDNA和氨基酸序列同源性分别为99%和98%.采用RT-PCR技术检测4只21日龄正常肉鸡和4只21日龄AS患鸡肺脏HIF-1α mRNA,结果表明,AS患鸡肺脏HIF-1α mRNA表达丰度极显著高于正常肉鸡（P《0.01）.本试验证明,HIF-1α与肉鸡肺动脉高压导致的腹水综合征相关.