蓝细菌16S rRNA双甲基化酶基因ksgA的进化分析、蛋白结构预测及功能验证

为研究核糖体小亚基rRNA双甲基化酶基因ksgA的进化关系、蛋白结构和功能,利用MEGA 5.2软件构建了37种蓝细菌ksgA基因和16S rDNA的系统进化树,通过SWISS-MODEL分析和预测KsgA的蛋白质结构模型,并通过克隆集胞蓝细菌Synechocystis sp.strain PCC 6803、鱼腥蓝细菌Anabaena sp.strain PCC7120和聚球蓝细菌Synechococcus elongates sp.strain PCC 7942的ksgA基因对大肠杆菌ksgA突变体进行了异源互补.结果表明:ksgA基因在蓝细菌中与16S rDNA进化分支高度相似,且体现出蓝细菌进化的聚类特征;蓝细菌KsgA甲基化酶与该蛋白家族的其他蛋白质拥有共同的保守结构、催化位点和配体结合位点;克隆的3种蓝细菌ksgA基因均能在一定程度上互补大肠杆菌ksgA基因的功能.     

无害化污泥与钼尾矿配施对沙化潮土土壤质量的影响

以小麦-玉米轮作体系下的沙化潮土为研究对象,通过2012—2015年3年5季田间定位试验,选用经过无害化处理且符合国家相关标准的商业化污泥和钼尾矿产品,研究无害化污泥与钼尾矿施用对我国典型沙化潮土土壤质量指标的影响,为无害化污泥与钼尾矿资源化利用提供理论和技术依据。结果表明:45 t·hm~(-2)污泥(W3)与钼尾矿配施对沙化潮土有机质(SOM)的提升效果最明显,SOM在玉米季W3+75 t·hm~(-2)(M1)处理显著增加了165.10%,在小麦季W3+M2处理显著增加了106.10%(P0.05);相比单施同一水平污泥,污泥与75 t·hm~(-2)钼尾矿配施下土壤0.25 mm水稳性团聚体(WR0.25)含量,平均质量直径(MWD)和几何平均直径(GMD)分别显著升高了38.04%~60.24%,28.45%~45.27%和41.34%~67.77%(P0.05),对促进土壤形成水稳性团聚体以及提高水稳性团聚体稳定性的作用更为突出;45 t·hm~(-2)污泥与75 t·hm~(-2)钼尾矿配施对沙化潮土微生物量碳(SMBC)和微生物量氮(SMBN)提升效果最明显,在玉米季分别显著提高了235.52%和156.79%(P0.05),在小麦季分别显著提高了249.24%和128.32%(P0.05);单施污泥和污泥配施75 t·hm~(-2)钼尾矿处理土壤微生物量熵(q MB)在玉米季和小麦季分别显著提高了21.95%~46.25%和36.38%~71.17%(P0.05)。但污泥与高量钼尾矿配施,SMBC、SMBN和q MB较单施同一水平污泥和与75 t·hm~(-2)钼尾矿配施的处理在玉米季分别下降了3.89%~19.85%、4.31%~17.86%和6.95%~33.47%,在小麦季分别下降了5.34%~23.24%、4.33%~28.08%和3.09%~32.33%,表明钼尾矿高量施用时会降低微生物活性。由灰色关联度分析方法得出,45 t·hm~(-2)无害化污泥与75 t·hm~(-2)钼尾矿配施(W3+M1)能显著提高沙化潮土SOM、SMBC、SMBN和q MB,并提高土壤平均质量直径(MWD)和几何平均直径(GMD),有效改善沙化潮土质量,在3年5季试验期间也未发现土壤和作物籽粒受到重金属污染。同时,W3+M1处理显著提升了土壤肥力等级至Ⅰ级,在此基础上,可以酌情不再施用污泥和钼尾矿。     

基于iTRAQ技术的冠心病血瘀证蛋白质谱研究

目的 探索冠心病血瘀证差异蛋白质谱,从蛋白水平阐释冠心病血瘀证的生物学机制。方法 对冠心病血瘀证与非血瘀证两组,应用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术分离、鉴定两组的差异蛋白质。结果 鉴定到的蛋白质数量780个。两组共有27个蛋白点表达相差1.5倍以上,其中11个上调,16个下调。上调的差异蛋白中主要功能涉及免疫反应、细胞间粘附作用主要指血小板参与的凝血反应、脂质代谢。下调的差异蛋白中主要功能涉及血小板细胞变形、细胞与细胞间关系迁移、细胞损伤表达。结论 冠心病血瘀证与免疫反应、血小板参与凝血反应的亢进,以及影响血小板形态变化、血小板间、血管内皮细胞与血小板的粘附迁移有密切的关系。     

玉米秸秆低温高效降解复合菌系GF-20的菌种组成及降解稳定性

【目的】探索不同温度及pH条件对玉米秸秆低温高效降解复合菌系的玉米秸秆分解稳定性及菌群结构稳定性的影响,完善菌系培养方法,促进其应用开发利用。【方法】以低温高效降解复合菌系GF-20为研究对象,在10℃条件下连续继代培养45代、不同温度和pH条件下连续继代培养15代,分别获得多组不同代数（F）、不同温度（T）和pH（P）条件下的菌系。测定各复合菌系发酵液pH、玉米秸秆降解率及纤维素酶活,评价复合菌系的玉米秸秆分解稳定性;利用PCR-DGGE技术结合主成分分析法对菌群组成结构的稳定性进行研究。【结果】在10℃条件下经连续继代培养40代和在温度4-30℃、pH 6.0-9.0条件下继代培养获得的不同复合菌系发酵液pH均随发酵时间的延长趋近中性;玉米秸秆降解率在27.59%-32.53%,除F40显著高于F5外,其余无显著差异;纤维素酶活性呈高代菌系大于低代菌系,温度4-10℃和pH 6.0-9.0条件下,对复合菌系产酶有促进作用,纤维素酶活为1.34-1.84 IU·mL^-1;复合菌系的纤维素酶在较低的温度和较宽的pH范围内具有良好的温度和pH稳定性,酶促反应温度15-30℃和pH 4.0-9.0内仍保持80%以上的纤维素酶活力;复合菌系F5-F45、T4-T30和P6.0-P9.0的DGGE条带差异不显著,表明菌系的菌种组成稳定;而在偏酸（pH=4、5）和偏碱性（pH=10）条件下继代培养,复合菌系秸秆降解率和纤维素酶活均显著降低,菌种组成发生变化,进而影响性质与功能稳定性。PCR-DGGE共检测到18个条带,其中关键菌株分别为Bacillus licheniformis、Azonexus hydrophilusd、Azospira oryzae、Arobacter cloacae、Cellvibrio mixtus、Bacillus tequilensis、Clostridium populeti subsp. Mixtus和Clostridium xylanolyticum。【结论】复合菌系GF-20在温度4-30℃、pH 6.0-9.0条件下经过多代继代培养,仍然保持了较高的玉米秸秆分解活性和菌种组成稳定性,具有良好的应用前景。     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

不同品种小麦下土壤微生物量和可溶性有机物对不同施氮量的响应

【目的】辽春10号和辽春18号小麦是常见的两个小麦品种,但是关于这两个小麦品种在不同施氮量下对维持土壤肥力的差异性方面还未知,因此探讨土壤中活性有机库（微生物量碳氮和土壤可溶性有机碳氮）在各生育期的动态变化,以此来评价土壤活性有机库对不同施氮量的响应以及转化。【方法】以不同品种盆栽小麦为研究对象,在不同施氮量（N0:0 kg·hm^-2、N1:45 kg·hm^-2、N2:90 kg·hm^-2、N3:135 kg·hm^-2、N4:180 kg·hm^-2、N5:225 kg·hm^-2）的设定下,探究土壤活性有机库在小麦生育期内的动态变化及相互关系。【结果】小麦生育期以及氮水平对土壤微生物量碳氮和可溶性有机碳氮的含量有显著影响（P＜0.01）;除可溶性有机碳和有机碳外（P＞0.05）,小麦品种对土壤微生物量碳氮和可溶性有机氮均有显著影响（P＜0.01）。施用氮肥能够显著提高土壤微生物量碳氮和可溶性有机碳氮的含量（P＜0.05）,并且随施氮量的增加,土壤微生物量碳氮和可溶性有机碳氮在N3处理达到最大,然后随施氮量的增加而降低,特别是在N5处理下,土壤可溶性有机碳氮的含量均低于不施氮肥处理（N0）;与微生物量氮和可溶性有机碳相比,施用氮肥对土壤微生物量碳和土壤可溶性有机氮含量的增幅更大;土壤微生物量碳/土壤微生物量氮在N5处理下最大（平均值分别为13.28和11.45）,而在N3处理下最低（平均值分别为7.94和7.83）。在小麦整个生育期内,土壤微生物量碳氮和可溶性有机碳氮含量均在开花期最大,其次为收获期、拔节期和分蘖期,苗期最小,总的来说,在各个时期土壤可溶性有机碳与微生物量碳以及土壤可溶性有机氮与微生物量氮之间均有着显著的正相关关系（P＜0.01）;两个不同品种小麦之间,其地上生物量均没有显著差异（P＞0.05）,但随施氮量的增加,呈先增加后降低的趋势,并且随小麦生育期而增加;而土壤有机碳和土壤全氮也在N3处理达到最大,并且随生育期而增加,在收获期达到最大。【结论】适宜氮量（N3）能够更好地协调土壤中微生物量碳氮和可溶性有机碳氮在小麦生育期内的转化及维持土壤生产力。     

稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆

【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。     

环保型饲粮对生长猪生长性能和养分排泄量的影响

为研究低蛋白质饲粮添加植酸酶、非淀粉多糖酶(NSP)和氨基酸微量元素对生长猪生长性能、养分排泄量的影响,选用90头平均初始体重为(41.92±2.6)kg的杜长大三元杂交猪,分为5组,设置1组为对照组,试验组采用低蛋白饲粮,试验2组为添加植酸酶处理;试验3组为添加氨基酸微量元素+植酸酶处理,试验4组为添加植酸酶+NSP酶处理,试验5组为添加氨基酸微量元素+植酸酶+NSP酶,试验期38d。结果表明,试验2组平均日增重、料重比分别比1组提高7.64%和1.94%(P0.05),其余各组间差异不显著(P0.05);粪N浓度2、3、4、5组比1组分别降低18.58%、20.65%、23.01%和21.24%(P0.05);粪P浓度2、3、4、5组比1组分别降低40.23%、38.31%、39.08%和39.85%(P0.01);粪Cu、Fe浓度2、3、4、5组与1组相比极显著降低(P0.01);粪Zn浓度2、3、4、5组与1组相比显著降低(P0.05)。由此可见,低蛋白质饲粮添加植酸酶处理,能显著提高生长猪平均日增重,显著减少粪中氮、锌含量,极显著减少粪磷、铜、铁含量;在此基础上,继续应用氨基酸微量元素等量替代相应的无机硫酸盐及添加NSP酶均对生长猪生长性能和粪中养分含量的影响差异不显著。     

茶渣蛋白提取工艺条件的优化

为实现茶渣副产物资源的综合利用,提高茶渣蛋白提取率,用碱浸提法提取废茶渣蛋白,通过单因素试验分析不同提取温度、NaOH浓度、提取时间和液固比对茶渣蛋白提取得率的影响。并在单因素筛选试验的基础上,运用Design Expert 8统计分析软件,设计4因素5水平响应面试验对提取温度、NaOH浓度、提取时间和液固比进行优化。结果表明:茶渣蛋白的最佳提取条件为提取温度50℃、NaOH浓度0.1mol/L、液固比45∶1、提取时间4h;在该条件下,茶渣蛋白提取得率为58.94%。     

复合微生物菌肥对二氯喹啉酸危害下烟草光合特性的修复作用

为探讨复合微生物菌肥对受二氯喹啉酸危害烟株光合特性的修复作用,采用盆栽试验,研究了3种复合微生物菌肥对受二氯喹啉酸危害烟草叶绿素含量、净光合速率、叶片蒸腾速率、气孔导度、胞间CO_2浓度和气孔限制值的影响。结果表明,受二氯喹啉酸危害烟草的叶绿素含量、净光合速率、叶片蒸腾速率、气孔导度和气孔限制值下降,胞间CO_2浓度升高;土壤中加入复合微生物菌肥修复后,这6项指标接近正常对照;在20 d时,经菌肥1、菌肥2和菌肥3修复的烟草叶绿素含量比受害对照分别增加了37.31%、46.27%和62.68%,净光合速率增加了19.87%、26.04%和48.59%,叶片蒸腾速率增加了5.62%、7.87%和16.85%,气孔导度提高10.71%、21.43%和39.29%,胞间CO_2浓度和气孔限制值接近正常对照。可以看出,3种复合微生物菌肥修复受害烟草光合特性的效果为菌肥3菌肥2菌肥1,以菌肥3效果最佳。