禽呼肠病毒感染对SPF鸡外周血T细胞亚型变化和细胞因子转录的影响

为探讨禽呼肠病毒(ARV)对SPF鸡外周血淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞数量变化和细胞因子mRNA转录水平的影响,利用流式细胞术和实时荧光定量PCR方法分别测定了ARV感染后1、7、14、21、28、35d感染组和对照组SPF鸡外周血淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞含量和细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α基因mRNA相对转录时相。流式细胞术检测结果表明,SPF鸡感染ARV后7d和14dCD4+、CD8+T细胞比值高于对照组,其中感染7d,CD8+T细胞含量差异显著(P0.05);感染后1、21、28、35d感染组CD4+、CD8+T细胞比值均低于对照组,感染1d后CD4+、CD8+T细胞含量均差异显著(P0.05),说明外周血T细胞亚型变化是ARV感染的重要表现之一。实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,感染组外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-6(除7d外)、IL-18(除14d外)和TNF-α在整个感染过程中表达上调,IL-17和IFN-γ除感染1d外,均表达下调,说明IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α均参与了ARV的感染进程。     

禽呼肠孤病毒分子生物学研究进展

本文就十几年来有关呼肠孤病毒的特性、基因组、基因重组、病毒蛋白、诊断方法等分子生物学的研究进行了综述,并指出了禽呼肠孤病毒分子生物学研究中存在的问题,及进一步研究的方向。     

紫外线诱变建立草鱼抗出血病病原病毒的AHZC88细胞株

通过UV对草鱼出血病病原病毒敏感的草鱼ZC 7901细胞株反覆诱变,获得了对出血病病原病毒具有抗性的AHZC 88细胞株。经生物学特性测定,AHZC 88细胞的染色体2n=48,温度适应范围4°～38℃,最适生长温度27℃,分裂指数在36小时时达最高值。经病原病毒的人工侵染等试验表明,AHZC 88细胞不受草鱼出血病病毒感染。在电镜切片观察中,细胞内不见病毒颗粒。LDH同工酶分析,比敏感细胞少1条酶带。     

禽呼肠孤病毒鸡源分离株的鉴定与人工感染试验

从临床患病鸡关节病料中分离到一株病毒，在电镜下观察到病毒粒子无囊膜，有双层衣壳，外衣壳直径约75nm，内核约50nm；分离病毒株对酸、热有较强的抵抗力，对乙醚不敏感；病毒感染鸡胚成纤维细胞上能产生以融合细胞为特征的CPE；爪垫接种1日龄雏鸡表现出明显的病毒性关节炎临床症状，并伴有吸收障碍型和坏死型的病理变化；血清中和交叉试验表明，该病毒分离株与国内的2株番鸭源呼肠孤病毒（YH和YB）分离株和国外S1133呈不同程度的交叉反应。通过对分离病毒株进行电镜观察、理化特性试验、病毒感染力测定、致病性试验、血清学试验，可以确定该分离病毒为禽呼肠孤病毒。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定禽呼肠孤病毒

从感染禽呼肠孤病毒的细胞中,以SDS和酚提取病毒核酸,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法将分节段的核酸分开,经银染色显示,呈3-3-1-3分布,此法可用于禽呼肠孤病毒的快速检测、鉴定。同样方法未能使传染性法氏囊病毒核酸显示。     

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7重组疫苗的构建及其免疫效力评价

为探明呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7基因工程亚单位疫苗产生的抗体效价水平和免疫保护力,用RTPCR方法,从GCRV中扩增到VP7基因片段,并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,得到重组质粒pETVP7,酶切鉴定后,将pETVP7转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,产生的重组蛋白经变性和复性后,按0.5、1.0、2.0 mg/尾的注射剂量分为3个免疫组,以等体积的氢氧化铝为佐剂进行注射。经SDSPAGE电泳分析,发现了相对分子质量为34 000的蛋白表达带;Western Blot检测结果显示表达的蛋白具有很好的抗原性;间接凝集试验结果表明,3个免疫组均有抗体产生;攻毒试验结果表明,0.5、1.0、2.0 mg/尾重组蛋白剂量组的保护率分别为90%、85%、90%,对照组为0,表明所构建的疫苗具有较好的免疫作用。     

禽呼肠病毒感染鸡胚成纤维细胞后Toll样受体mRNA转录水平的动态变化

为分析禽呼肠病毒(ARV)标准毒株S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)后对相关鸡Toll样受体(ChTLRs)mRNA转录水平的影响作用,利用实时荧光定量PCR,测定和分析ARV-S1133感染CEF后ARV结构蛋白σC和ChTLRs的mRNA转录水平变化情况。结果表明,ARV-S1133感染CEF 10h后,ARVσC蛋白的mRNA相对表达量开始迅速上升,在48h达到峰值;同时,感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21mRNA表达量发生显著变化,在感染72h内各个受体的mRNA表达量呈波浪式变化。5个不同滴度的ARV感染CEF 24 h后,ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21mRNA转录水平与病毒滴度均呈正线性相关。上述结果表明,ARV感染后可诱导CEF ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA转录水平发生变化,可能与禽呼肠病毒的复制和致病机制相关。     

禽呼肠孤病毒C-98分离株S3基因的克隆及序列分析

参考GenBank中禽呼肠孤病毒S3基因序列设计一对引物,以禽呼肠孤病毒内蒙古分离株(C-98)基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法获得病毒的S3基因,并克隆到pMD19-T载体后测序。应用计算机软件将所测定序列与参考毒株ARV 176、ARV S1133、ARV 138的S3基因序列进行比较,核苷酸同源性分别为99.8%,99.6%,87.7%,推导其氨基酸同源性分别为99.5%,98.9%,94.8%。应用PHD程序和DNAStar软件,对S3基因所编码的σB蛋白结构进行预测,结果表明,σB蛋白为结构紧密的球状蛋白分子。     

新型鸭呼肠孤病毒在DF-1细胞系中的增殖特性

为了研究新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)在鸡胚成纤维细胞DF-1中的增殖特性,将NDRV JDM10毒株接种到DF-1细胞,连续传代后,通过观察病毒对细胞的致病变效应,测定半数组织感染量(TCID₅₀)、RT-PCR检测、间接免疫荧光(IFA)及Western-blot免疫学检测,探索NDRV对DF-1细胞的作用效果。结果表明,NDRV JDM10毒株在DF-1细胞中能有效增殖,产生明显的致病变效应;RT-PCR检测成功扩增出1条大小为1 001 bp的条带;病毒蛋白在细胞中获得了良好的表达,并与抗NDRV σC单克隆抗体发生特异性反应;NDRV JDM10毒株在感染DF-1细胞后会经历潜伏期、快速增长期、稳定期3个时期,并在72 h病毒效价达到峰值,TCID₅₀为1×10^-7.90·(0.1mL)^-1。本研究为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞疫苗奠定了基础。     

草鱼呼肠病毒研究进展

由草鱼呼肠病毒引起的草鱼出血病是一种高度传染性与致死性的病毒性疾病,该病的频繁暴发给我国草鱼养殖业及淡水养殖业造成了巨大的经济损失。论文就近年来对草鱼呼肠病毒在基因组序列及基因分型、流行病学、先天性免疫、检测方法、免疫防控等方面的研究进行综述,以期为草鱼呼肠病毒的研究提供借鉴和参考,为草鱼出血病预防和控制提供帮助。