谷氨酸棒杆菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达

采用PCR方法从谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）基因组中分离得到2.4 kb的麦芽寡糖基     

酷暑对兔体温和猪瘟定型热比率的影响

选用无猪瘟抗体原料兔作试验,研究酷暑对兔体温变化及注射猪瘟兔化弱毒脾淋乳浆液后产生定型热比率的影响。结果表明,当兔体周围气温达38℃时,100%的兔体温超过41℃;当环境温度达35.5℃时,100%的兔体温超过40℃。这些试验兔群表现出不同程度的中暑症状。发生中暑的试验兔群,在22℃的GMP生产动物房内饲养3 d后,每只注射含4 000个发热单位的猪瘟兔化弱毒脾淋乳浆液,5个试验组所产生的定型热比率分别为47%、65%、73%、54%、63%;而饲养于17~25℃舒适气温中的无猪瘟抗体兔群,转移到22℃的GMP生产动物房,注射相同病毒量后,产生定型热比率为98%、96%。上述结果表明在猪瘟兔化弱毒脾淋疫苗生产中,GMP生产动物房必须给兔子提供最舒适的室温,原料兔在生产后期和运输过程中也应避免中暑。但中暑过的试验兔,若能产生定型热,其脾淋毒价仍符合制造活疫苗的要求。     

猪瘟病毒E2基因DNA疫苗的试验研究

用构建的E2-pcDNA4.0 DNA疫苗对Balb/c小鼠、家兔和仔猪进行免疫,经3次肌肉接种,间隔15 d免疫后,测定抗体水平.结果表明,构建的DNA疫苗能诱导小鼠产生中和性抗体,免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量(M ID)的猪瘟兔化弱毒苗的攻击.攻毒试验结果表明,E2-pcDNA4.0 DNA疫苗可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击.     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG-基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK-/gI-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoRⅤ/StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRⅤ。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRⅤ,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。     

利用烟草表达重组人胰岛素原的初步研究

按植物偏爱密码子设计合成了228 bp带his-tag(6×his)人胰岛素原基因(hmins),随后构建了植物双元表达载体p35S::hmins(骨架质粒是pCAMBIA2300),通过冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105制备工程菌,用农杆菌介导法转化烟草叶盘.经卡那霉素(50 mg·L-1)筛选获得98株抗性植株,PCR和southern blotting分析确认获得了6株独立转基因烟草,hmins在转基因烟草基因组中的拷贝数介于2-4;RT-PCR和western blotting分析结果表明,hmins在转基因烟草中成功表达(转录和翻译水平);ELISA结果显示,hmins在转基因烟草叶片中表达量为0.5～1.1μg·g-1·FW.该研究为植物源胰岛素研制做了必要的前期准备.     

秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。     

抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。     

鹅巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗的研制

为了有效控制霍尔多巴吉鹅巴氏杆菌病(Pasteurellosis)的发生,将内蒙古通辽地区分离鉴定的巴氏杆菌作为菌种,采用液体增菌培养后灭活,加入佐剂制成油乳剂灭活疫苗,经无菌和安全检验合格后免疫20日龄雏鹅(0.5 mL/只)。结果表明,该疫苗免疫效果良好,1次免疫后保护率达73.3%,2次免疫后保护率达96.7%。