H5N1亚型禽流感病毒NA基因在Sf9昆虫细胞中的表达

【目的】在Sf9昆虫细胞中表达H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)神经氨酸酶(NA)基因。【方法】用PCR方法克隆H5N1亚型AIVNA基因,定点插入到转移载体pFastBacHTb中,构建重组转移载体pFastBacHTb-NA。将其转化到含有AcBacmid和helper质粒的E.coliDH10B感受态细胞中,与AcBacmid重组,获得rAcBacmid-NA。提取重组的Bacmid,转染处于对数生长期的昆虫Sf9细胞,获得重组杆状病毒vAc-NA。将vAc-NA重新感染处于对数生长期的昆虫Sf9细胞,3~5 d后收集被感染细胞。取转染细胞、感染细胞、破碎感染细胞上清和破碎感染细胞沉淀进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。【结果】通过PCR成功地克隆了1 352 bp的H5N1亚型AIV不含信号肽序列的NA基因;pFastBacHTb-NA和rAcBacmid-NA构建成功。AIVNA基因在昆虫Sf9细胞内得到有效表达,表达产物分子质量约为52 ku,且具有免疫原性。【结论】H5N1亚型AIVNA基因在昆虫Sf9细胞中表达成功。     

玉米重组近交系的高质分析

本研究以自交系掖478、丹340及其衍生的345个F_(3:4)重组自交系(RIL)为材料,对该群体穗长(EL)、穗粗(ED)、穗行数(KRE)、行粒数(KRN)、干籽重(DSW)、百粒重(100-GW)等6个重要穗部性状进行方差、相关性分析,正态性检测。结果表明:除100-GW外,其他各性状在345个家系间存在真实的遗传差异;F_(3:4)家系的6个主要穗部性状均表现出数量遗传特点,其平均值接近双亲平均值,有一定数量的双向超亲家系,是一个适合遗传作图的理想群体。     

水稻主要农艺性状的QTL分析

【目的】通过对水稻Oryza sativa主要农艺性状的遗传研究,挖掘优异主效QTL,为利用分子标记辅助选择进行高产、优质育种提供理论基础.【方法】以粳稻品系中野1211与籼稻品系中大304构建的重组自交系群体188个家系为试验材料,利用该重组自交系群体构建的含有142个SSR标记分子连锁图,采用区间作图法对抽穗期、单株有效穗数、株高、穗长、每穗实粒数、每穗总粒数、结实率、穗着粒密度、粒长、粒宽、粒形、千粒质量和单株质量13个主要农艺性状进行早、晚季的全基因组QTL定位.【结果和结论】除株高没有检测到相关的QTL之外,其余的每个性状检测到的QTL数目为2~15个.12个性状共检测到73个QTL,分布于水稻的12条染色体上,其中仅在早季能检测到的有34个,仅在晚季能检测到的有23个,两季都能检测到的只有16个.单个QTL的贡献率在5.3%~28.4%之间,其中超过20%以上的有10个.检测到的新位点为12个.早晚两季在多数染色体的多处区段上均检测到多个紧密连锁的QTL.检测到的12个新位点为水稻主要农艺性状的QTL定位增加了新的遗传信息,重复检测到的16个QTL可用于水稻分子标记辅助育种.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.     

秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。     

罗氏沼虾GIH–like基因的克隆与原核表达

运用RT–PCR技术获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii) GIH–like基因的开放阅读框(ORF)序列,通过荧光定量PCR技术检测该基因在罗氏沼虾不同组织中的表达量,并运用原核表达技术诱导表达罗氏沼虾GIH–like成熟肽的重组蛋白。结果显示：罗氏沼虾GIH–like的ORF全长为339 bp,共编码112个氨基酸残基,其中包含34个氨基酸组成的信号肽及78个氨基酸组成的成熟肽,具有CHH家族Ⅱ型肽的典型特征;同源性和进化关系分析表明,罗氏沼虾GIH–like与日本沼虾GIH的同源性最高,亲缘关系最近;荧光定量PCR结果显示,罗氏沼虾GIH–like在眼柄中的表达量最高,极显著(P<0.01)高于其他组织的,在脑、神经节、心脏等组织中表达量较低;诱导表达的罗氏沼虾GIH–like重组蛋白的相对分子质量约为2.6×10⁴,除去标签蛋白后约为8.5×10³,与Prot Param预测的9.4×10³接近。     

H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。     

表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa^[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF（moi=0.01）,每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10^6.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.5TCID₅₀/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。     

表达PRRSV GP2a/GP2b、GP3、GP4、GP5和M蛋白重组腺病毒的构建

以PRRSV FJ-1a株为模板,采用RT-PCR法分别扩增出GP2a/GP2b-3、GP3、GP4、GP5和M蛋白基因片段,双酶切后插入穿梭质粒pDC316.利用AdMaxTM法,将5个重组穿梭质粒分别与腺病毒辅助质粒共转染293细胞,得到重组腺病毒Ad-GP2a/GP2b-3、Ad-GP3、Ad-GP4、Ad-GP5和Ad-M.重组腺病毒滴度为107.7～109.0TCID50·mL-1,而以Ad-GP5滴度最低,仅为107.7TCID50·mL-1.PCR检测第3、6、9代重组腺病毒稳定性,确证重组病毒均能稳定携带目的基因.对目的基因转录的RT-PCR鉴定结果显示,重组腺病毒分别感染293细胞后能转录产生目的基因mRNA.表达PRRSV主要囊膜蛋白基因重组腺病毒的获得,为进一步研制PRRSV基因工程疫苗,解析主要囊膜蛋白功能奠定基础.     

猪瘟病毒荧光定量PCR标准阳性模板的构建

设计扩增猪瘟病毒(swine fever virus,SFV)核酸5’端非翻译区的引物,采用RT-PCR方法克隆目的片段并插入PMD一18 simple T质粒,重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,提取质粒经PCR和序列测定证实为阳性重组质粒,命名为pSF。将构建的pSF作为标准阳性模板进行荧光定量PCR(FQ-PCR)检测表明,此模板在一20℃保存6个月对结果无显著影响;对于1×10 9,1×10 7,1×10 5拷贝／2μL 的pSF用FQ-PCR方法测定的ct值最大变异系数分别为1．55％;使用该模板建立的定量范围为1×10 2—1×10 11拷贝／2 μL ;构建的阳性重组质粒pSF具有良好的稳定性和特异性。该方法可以用于临床诊断。