细胞因子在奶牛乳房炎生物学防治中的应用

鉴于细胞因子对乳房免疫机能独特有效的操纵和调节,在奶牛乳房炎控制中具有一定独特优势,作者就细胞因子的生物学活性、作用机制和特点进行了综述,并重点对国内外应用奶牛重组细胞因子防治奶牛乳房炎进行了总结、分析,有望为控制奶牛乳房炎提供安全、有效、实用的生物学防治途径。     

EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)在重组大肠杆菌中的表达条件研究

本研究以EGCG-O-甲基转移酶（EOMT）催化EGCG生成EGCG3"Me的产量为主要指标,探讨了重组大肠杆菌内EGCG-O-甲基转移酶的诱导表达条件。结果表明,当诱导剂IPTG终浓度为0.05mmol/L,诱导时间为20h,培养基初始pH为7.0,以及诱导温度为20℃时,EOMT的表达效果最佳。     

重组猪α干扰素冻干保护剂的筛选

为使重组猪仪干扰素（rPoIFN—α）制品更好地应用于生产实践中,采用保守的冻干工艺重点对rPoIFN-α制品的冻干保护剂进行筛选,通过外观检测、水分含量、活性检测对14种冻干保护剂进行了比较和筛选。研究结果表明,终浓度2％、4％和5％的甘露醇的保护效果较好,活性保持率分别为102．8％、95．1％、108．3％。按照活性好的这三个配方再冻干三批制品进行放置40℃加速稳定性实验。结果表明,在40℃放置三个月后,三个保护剂制品效价基本没变化,稳定性良好,有效期暂定为两年。本研究初步探索了rPoIFN一仪的冻干配方,为rPoIFN-α的产业化打下了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒表面的展示

本试验将猪圆环病毒2型(PCV2)去核定位区ORF2基因克隆到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC中,转化DH10Bac大肠杆菌感受态,经抗性及蓝白斑筛选得到含ORF2基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。对重组病毒进行Western-blot分析和免疫金电子显微镜检测。结果表明,PCV2 Cap蛋白在重组杆状病毒中获得表达;免疫金电子显微镜观察表明,重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。本试验成功构建表面展示PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用重组杆状病毒作为亚单位疫苗奠定基础。     

猪圆环病毒2型核酸疫苗的小鼠免疫保护试验

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)核酸疫苗在小鼠攻毒试验中的免疫保护效果,以PCV-2 GXWZ-1株为模板,扩增出ORF2基因及其截短基因8个片段(A(ORF2)、B(51-100aa)、C(101-150aa)、D(181-235aa)、E(151-200aa)、F(51-150aa)、G(101-235aa)、H(51-235aa)),将其插入到pcDNA3.0载体中,构建出真核表达质粒,并将其转染至PK-15细胞,用间接免疫荧光试验检测其瞬时表达情况。将试验小鼠随机分成9组,其中免疫组7组,阴阳性对照各1组,将纯化的真核表达质粒对小鼠进行组合免疫;二免后,用经处理过的PCV-2 GXWZ-2株阳性病料悬液腹腔注射免疫组和非免疫对照组小鼠,阴性对照组用生理盐水腹腔注射;其后进行体重记录、病理切片制作及PCR检测。结果表明:共有6个真核表达质粒成功在PK-15细胞中表达。在攻毒后的3周内,阳性对照组小鼠PCR诊断均为阳性;免疫组中,部分组小鼠在攻毒后第1周或在第2周为阳性,到第3周时各免疫组小鼠全部为阴性;阴性对照组始终为阴性。免疫组在病理保护学方面明显优于非免疫对照组,非免疫对照组的体重增长速率略低于免疫组和阴性对照组。由此可见猪圆环病毒2型核酸疫苗在小鼠攻毒试验中有明显的保护作用。     

表达Ⅰ型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建

扩增鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因,并在其中间引入Bgl II酶切位点,再之克隆到pUC19载体,获得载体pTK。用限制性内切酶从已有质粒pcDNA-LacZ上切下CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒,插入到pTK的TK基因中,获得质粒pTCL。用质粒T-VP1做模板,扩增出I型鸭甲肝病毒(以前称为血清I型鸭肝炎病毒)VP1基因,克隆到质粒pTCL表达盒的多克隆位点KpnI与XbaI之间,构建含LacZ及VP1基因的转移载体质粒pT-CL-VP1。将此转移载体与鸭瘟病毒C-KCE毒株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒。     

重组表达抗菌肽Hadrurin抗菌活性分析

为了给表达高活性的抗菌肽Hadrurin提供开发应用的依据,进一步为用基因工程方法生产具有多种生物活性的抗菌肽Hadrurin蛋白提供研究基础,本研究表达获得重组抗菌肽Hadrurin(rHadrurin)蛋白的基础上,将纯化的rHadrurin蛋白进行肠激酶酶切,恢复其天然活性结构。用最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)方法检测抗菌肽Hadrurin在不同剂量、不同pH值、不同保存温度下对鸡致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性及杀菌活性。并以小鼠为动物模型,进行抗菌肽rHadrurind对小鼠的体内保护实验。结果表明抗菌肽rHadrurin对上述细菌的最小抑菌范围为1.32μg/mL～4.32μg/mL,最小杀菌范围为1.77μg/mL～8.54μg/mL,而且-70℃～100℃及在pH3～pH10条件下仍具有高效抗菌活性。240μg/只剂量的抗菌肽蛋白可有效预防保护小鼠免受致死剂量鸡致病性大肠杆菌攻击,320μg/只剂量可达到保护率85%以上。     

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因和猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒的构建及其在小鼠模型上的免疫原性分析

本研究旨在以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,构建一株同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组腺病毒疫苗。首先利用重叠PCR将GP5和E2基因通过口蹄疫病毒(FMDV)2A序列连接,形成一个完整的ORF,并将其克隆到腺病毒穿梭载体中,通过细菌内同源重组构建共表达PRRSVGP5蛋白和CSFVE2蛋白的重组腺病毒(rAdV-GP52AE2)。间接免疫荧光试验和western blot检测证实2个外源基因均获得表达。在小鼠上进行的免疫效力评价结果显示,rAdV-GP52AE2免疫组针对CSFV的中和抗体滴度可达1∶128,针对PRRSV的中和抗体滴度为1∶16;在淋巴细胞增殖试验中,免疫组与阴性对照组在增殖指数上有显著差异,表明该重组腺病毒可以同时诱导抗PRRSV和CSFV的特异性体液免疫和细胞免疫。这些结果显示,利用具有自动剪切功能的FMDV2A多肽构建的重组腺病毒有望开发成一种同时预防PRRS和CSF的新型载体疫苗。     

表达牛冠状病毒S1基因的重组人腺病毒的构建及鉴定

为构建表达牛冠状病毒(BCV)S1基因的重组人腺病毒疫苗,本实验通过人工合成密码子优化的截短BCV S1的基因片段(55 bp～1 650 bp)。将其克隆到重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,并以PmeⅠ线性化后转化含有人5型腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞,通过细菌内同源重组的方式获得重组腺病毒质粒pAdV-BCV-S1,经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞获得重组腺病毒rAdV-BCV-S1。利用间接免疫荧光法和western blot法检测该重组腺病毒的S1基因在AD-293细胞中的表达情况,同时用一步生长曲线法,测定该重组腺病毒的复制能力。结果表明:BCV S1基因在感染细胞中获得了高效表达:子代重组腺病毒在感染细胞后60 h滴度最高,为6.8×108 pfu/mL。该重组腺病毒的构建为BCV重组疫苗的研究奠定了基础。     

重组小麦组蛋白H4介导绿色荧光蛋白基因(pEGFP/C1)的转染

利用在大肠杆菌体内表达的重组小麦组蛋白H4与质粒DNA形成复合体后,通过琼脂糖凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证重组蛋白与DNA的结合情况;MTT法检测蛋白对细胞的毒性作用;转染细胞后,激光共聚焦显微镜检测荧光蛋白的表达。此重组蛋白能很好地结合质粒DNA,且能有效地保护DNA分子不受核酸酶降解,并能高效地携带绿色荧光蛋白基因pEGFP/C1转染进入卵巢癌细胞株H08910。