猪繁殖与呼吸综合征病毒重组M蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV M蛋白,将纯化后的重组M蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组M基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约435 bp的M基因片段,将目的片段亚克隆至pET32a(+)表达载体中,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组M蛋白,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测结果表明具有良好的抗原性和特异性。以重组M纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)其他6种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与商品化ELISA试剂盒的符合率为95.3%。本研究建立的M-ELISA检测方法将为猪群免疫PRRS疫苗后抗体水平监测及PRRSV野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便易行、快速、高通量的血清学抗体检测方法。     

猪细小病毒BQ-C毒株VP2基因的鉴定及表达

本研究从临床发病猪采集病料,以PK15传代细胞进行病毒分离,通过PCR、血液凝集试验(HA)和电镜鉴定为1株猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV),命名为BQ-C。对分离的毒株进行测序,结果显示该毒株与GenBank登录的PPV BQ株同源性为100%。为获得该毒株结构蛋白VP2基因的表达产物,将VP2基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+),得到表达重组质粒。经双酶切和测序鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE结果表明,获得的重组蛋白分子质量约为71.5 ku,与预期大小相符。Western blotting结果显示获得的重组蛋白能与PPV阳性血清特异性结合,表明重组蛋白具有良好的反应原性。结果表明,本研究成功分离了1株PPV BQ-C株,且表达的VP2重组蛋白可用于PPV血清学诊断和疫苗的研发。     

麋鹿重组朊蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

为研制鹿慢性消耗性疾病(chronic wasting disease,CWD)单克隆抗体,本研究以原核表达后经纯化的麋鹿重组成熟朊蛋白(PrP^c)为免疫原免疫PrP^c基因敲除小鼠(PrP^c-null mice)。两次加强免疫后,利用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,采用3次有限稀释法实现杂交瘤细胞的亚克隆,筛选出5株能稳定分泌针对麋鹿重组成熟朊蛋白特异性单克隆杭体(McAbs)的杂交瘤细胞株5A5、3B2、6D12、5E3、1F5,其腹水ELISA效价均达到1∶10000以上。经鉴定,5株单抗均为IgG抗体,5A5、6D12、5E3株为IgG1亚类,3B2、1F5株为IgG2a亚类。Western blotting鉴定结果表明,获得的McAbs均能特异性识别麋鹿重组成熟朊蛋白和健康麋鹿脑组织匀浆中的PrP^c。本研究制备了CWD腹水McAbs,同时也为CWD的研究及其诊断方法的建立奠定了基础。     

微小隐孢子虫重组蛋白CP21的免疫特性

采用微小隐孢子虫CP21基因的原核表达蛋白的抗血清对微小隐孢子虫感染HCT-8细胞进行了体外阻断试验,检测不同浓度抗血清对HCT-8细胞感染隐孢子虫感染率的影响.同时应用纯化的重组CP21蛋白对小鼠进行免疫,检测体液免疫水平和细胞免疫水平的变化.对免疫后的小鼠接种微小隐孢子虫,检测重组CP21蛋白对微小隐孢子虫感染的保...     

‘北京截头’×西双版纳黄瓜重组自交系群体重要农艺性状的遗传分析

利用‘北京截头’黄瓜×西双版纳黄瓜产生的永久性重组自交系(RIL)群体124个株系,对其苗期株高、第一雌花节位、第一分枝节位、初级分枝数、瓜长、瓜把长、瓜横径、瓜肉厚、瓜腔直径和单瓜重等10个重要农艺性状进行方差分析、相关分析和多元逐步回归分析以及通径分析。结果表明:这些性状在重组自交系群体中均存在双向超亲分离,分布频率大致接近正态分布。10个农艺性状在双亲之间均存在显著或极显著差异。瓜长和瓜横径均与单瓜重具有极显著相关关系,并解释了单瓜重89.0%的表型变异。瓜横径和瓜肉厚对单瓜重的通径分析与相关分析结果之间存在较大差异,表明通径分析更有利于解释性状之间的内在关系。     

猪瘟病毒E~(rns)和E2基因在昆虫细胞中的表达研究

利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBac HT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3~4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及Western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白.     

SpltNPV和SeNPV几丁质酶基因大肠杆菌表达产物对病毒的增效作用

为明确杆状病毒几丁质酶对病毒杀虫剂的增效作用,采用PCR扩增获得斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltNPV)不含N-端信号肽序列的几丁质酶基因片段SpltNPVChiA/S-和甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)几丁质酶基因编码区全序列SeNPVChiA,分别克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达,表达蛋白的分子量为62 kD和66 kD.将含有表达产物SphNPVChiA/S-和SeNPVChiA的大肠杆菌菌液分别与SphNPV或SeNPV一起加入人工饲料,饲喂3龄斜纹夜蛾或甜菜夜蛾幼虫,两种幼虫取食后致死时间均显著缩短,其中,SpltNPV Spit-NPVChiA/S-和SphNPV SeNPVChiA的LT50比SphNPV对照处理缩短0.90天和0.89天,LT90缩短1.90天和1.97天;SeNPV SphNPVChiA/S-和SeNPV SeNPVChiA的LT50比SeNPV对照处理缩短0.47天和0.50天,LT90缩短0.57天和0.59天;而pET-28a/BL21对病毒的侵染无明显增效作用.两种病毒几丁质酶基因的大肠杆菌表达产物对病毒早期侵染均有明显的增效作用,但同源几丁质酶和异源几丁质酶对病毒的增效作用没有显著差异.     

文蛤C1q基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤C1q基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸。在文蛤C1q(MmC1q)蛋白中,C1q结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的C1q结构域均具有较高的同源性。通过荧光实时定量PCR,MmC1q mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高。在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,C1q相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmC1qmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍。包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmC1q重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性。     

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.