用PCR检测副溶血性弧菌耐热溶血素基因

根据副溶血性弧菌的耐热溶血素基因（ｔｄｈ）设计了２对引物，经聚合酶链式反应（ＰＣＲ）检测，所有１８株神奈川试验阳性副溶血性弧菌均呈阳性反应，而６株神奈川试验阴性副溶血性弧菌呈阴性反应，其他９种（３４株）弧菌和８株其他革兰氏阴性菌也呈阴性反应。检测敏感性可达２ＣＦＵ的副溶血性弧菌。     

传染性造血器官坏死病毒焦磷酸测序检测技术的建立

根据传染性造血器官坏死病毒(IHNV)基因序列,设计了IHNV最为保守的指纹序列,以及测序引物,建立了IHNV焦磷酸测序检测方法。对所构建的IHNV焦磷酸检测方法进行特异性试验和灵敏度检测。结果表明,所建立的方法特异性好,在8种鱼类病毒中能够特异性检测出目的病毒,检测方法灵敏度高,最低检出核酸量为10pg/μL。对建立的焦磷酸测序检测方法进行了实际应用研究,选取国内采集与进口的鱼类样本共计80批次进行IHNV检测。结果显示,焦磷酸测序检测方法可以有效的检出常规RTPCR不能检出的假阴性样本和弱阳性样本,该方法的灵敏度和特异性可以满足水生动物疫病检测的需要。     

利用微滴数字PCR技术分析转基因大豆‘GE-J12’中外源基因的拷贝数

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lectin为参照,建立微滴数字PCR拷贝数检测体系。特异性试验结果显示,只有以抗除草剂转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板才有扩增信号。以单株转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板,进行外源目的基因G2-EPSPS和GAT、3′转化体特异性序列的微滴数字PCR检测,转基因大豆‘GE-J12’的外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值分别为0.99和1.01。同时3′转化体特异性序列的拷贝数均值为1.00,验证单株转基因大豆‘GE-J12’为纯合子,因此鉴定该单株转基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因组上为单拷贝插入,同时与Southern blot方法进行比较,结果一致。     

旋转式多比例分样方法对作物籽粒分样效果的研究

为验证旋转式多比例分样方法的可行性,探究旋转式多比例分样方法对作物籽粒的分样效果,以谷子、绿豆、大豆和玉米籽粒材料制备成混合样品,在不同转速（0～30.0r/min）处理和不同进样时间（60、90、120s）内比较旋转式多比例分样方法获得1/2、1/4、1/8和1/16子样的代表性和缩分比误差。结果表明,在转速0～30.0r/min和进样时间60～120s的情况下,旋转式多比例分样方法获得子样的分样误差和均无显著差异,且均不高于四分法（CK）。但是,除不旋转（0r/min）处理的1/8四盒和1/16单盒及30r/min处理的1/16单盒子样的缩分比误差显著高于对照外,旋转处理（转速≥7.5r/min）的单盒、双盒或四盒子样的缩分比误差不高于四分法对照。因此,在进行样品前处理的分样工作中应用旋转式多比例分样方法是可行的,应设置转速≥7.5r/min,取相对2个扇盒或十字相对4个扇盒形成的子样。     

牛副结核分枝杆菌LAMP快速检测方法的建立

为建立牛副结核分枝杆菌(MAP)的快速检测方法,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,以MAP的IS900基因序列为靶基因设计特异性引物,建立了MAP特异性的LAMP快速检测方法。经反应条件优化,检测结果显示,建立的LAMP检测方法具有良好的特异性,最低见测量为0.53 pg;与其他病原菌无任何交叉反应。临床样品检测与行业标准的符合率为100%。该LAMP检测方法可以用于MAP的常规检疫。     

VSV的RT-PCR快速检测方法的建立

选取水泡性口炎病毒 N基因序列 ,设计 1对引物 ,建立检测水泡性口炎病毒的 RT- PCR方法。对VSV各毒株进行检测 ,结果均为阳性 ,而对反刍动物病毒性疾病相关病毒进行检测 ,结果均为阴性。结果表明所建立的 RT- PCR技术可用于水泡性口炎的诊断和流行病学调查     

鸭Ⅰ型肝炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种快速检测鸭Ⅰ型肝炎病毒(DHV I)的方法,本研究根据基因库中DHV Ⅰ基因的保守序列,设计特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了DHV I的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10fg,高于常规PCR方法 100倍;全部反应可在1 h内完成;可以通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸭常见病原体的检测结果均为阴性。实验结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于DHV Ⅰ感染的快速检测。     

牛双芽巴贝斯虫PCR检测方法的建立及初步应用

根据PCR技术原理,建立起了牛双芽巴贝斯虫病PCR检测方法,并测定出该方法的敏感性为108.66 fg。特异性试验表明,除牛双芽巴贝斯虫出现特异扩增带(295 bp)外,其他的虫株均未出现特异性扩增带。采用PCR检测方法,通过对35份牛血样的检测,测得牛双芽巴贝斯虫病的阳性率为28.57%(10/35),说明PCR方法敏感性强、特异性高,不失为牛双芽巴贝斯虫病临床诊断的好方法。     

结肠小袋纤毛虫体外培养特性的初步观察

目的观察结肠小袋纤毛虫（Balantidium coli）在体外培养条件下的生长情况。方法取粪样分别置于4℃～8℃冰箱,28℃和37℃恒温培养箱中,观察记录虫体数量,统计不同温度条件下滋养体生存时间。28℃恒温条件下,将粪液加入不同稀释液（蒸馏水、生理盐水及洛克氏液）中,观察滋养体的活力及数量;采用同样的观察方法,统计滋养体在双相培养基以及免血水培养基内的生存时间。在28℃和37℃恒温条件下,分别观察滋乔体在RSS培养液（Ringer液＋血清＋米粉）及不加米粉的RSS培养液内的生存时间。结果结肠小袋纤毛虫滋养体在体外的最适生存温度为28℃,在洛克氏夜中生存时间明显长于生理盐水和蒸馏水,在RSS培养基及双相培养基中可在培养24h时达到高峰。在含有诺氟沙星的兔血水培养基中,滋养体的数量可在培养后96h达到高峰,生存时间可达到180h。结论结肠小袋纤毛虫体外培养受很多因素的影响,有待于进一步研究。     

猪伪狂犬病PCR诊断方法的建立

根据伪狂犬病病毒(PRV)gB基因的序列,设计并合成了一对引物,以闽A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测PRV的PCR方法,应用本方法对分离的病毒进行基因扩增,获得了217bp的特异性DNA片段,证明了对分离病毒检测的特异性和敏感性,为伪狂犬病的快速诊断提供了条件。