山东地区樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)的RT-PCR检测及外壳蛋白基因的克隆

为调查我省甜樱桃感染樱桃绿环斑驳病毒(Cherry Green Ring Mottle Virus,CGRMV)情况,本研究以甜樱桃(Prunus avium L.)品种"红灯"叶片总RNA为模板,根据CGRMV基因组序列设计特异引物,对山东地区37份甜樱桃"红灯"样品进行RT-PCR检测,共检测出19份阳性样品。利用CGRMV外壳蛋白基因序列引物,从阳性植物样本中分离到约800 bp的目的片段,克隆测序,序列分析显示该片段全长807 bp,编码268个氨基酸,与GenBank中已登录的CGRMV分离物的外壳蛋白基因序列一致性为87%～97%,氨基酸序列相似性为95%～99%。该结果表明山东地区甜樱桃生产园中感染CGRMV的病例较为普遍。     

抗虫转Bt基因水稻外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

以转基因Bt水稻品种科丰6号为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cry1Ac晶体蛋白毒素基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温30min,通过荧光显色完成对转基因检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cry1Ac基因,其最低定性检测限是传统PCR方法的10倍。本研究建立的针对转基因水稻cry1Ac基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因抗虫水稻的快速检测。     

水稻OsLEA5c基因的克隆、表达和抗逆性分析

为了研究水稻胚胎发育后期丰富蛋白基因OsLEA5c 的抗逆性,利用 RT PCR技术从水稻中克隆到OsLEA5c的 cDNA。序列分析表明,OsLEA5c基因的读码框为456 bp,编码1个由151个氨基酸残基组成的蛋白。蛋白分子量为16.55 kD,等电点为5.07。OsLEA5c蛋白的平均亲水系数（GRAVY）为0.020,为疏水蛋白。OsLEA5c蛋白的44－140位氨基酸残基形成 LEA_2结构域。进化树分析表明,OsLEA5 c属于第5组LEA蛋白的C亚组。OsLEA5 c与5 C亚组LEA蛋白的氨基酸一致性为45.14％～61.59％。利用基因重组技术构建的原核表达载体 pET32a Os-LEA5c,转化到E．coli BL21 pLysS菌株中,诱导得到34 kD的融合蛋白。OsLEA5c在大肠杆菌中的表达增加了大肠杆菌对高温、高盐、高渗透压和反复冻融的抗性。OsLEA5c 基因在水稻抗逆和种子成熟脱水过程中发挥重要作用。     

猪伪狂犬病毒湖北株gE基因的克隆与序列分析

[目的]通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因克隆和测序,分析其遗传变化规律。[方法]参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)gE基因的序列设计1对引物,对PRV湖北株gE基因进行PCR扩增和序列分析,PCR产物克隆到pMD 18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株进行同源性分析和比较。[结果]与标准参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%~98.0%,进化树分析表明,PRVHBXS2014株与河南焦作株EU561349-China同属于一个分支,亲缘关系较近,但存在个别位点的基因突变。[结论]为有效防控该病提供参考。     

利用产量功能基因标记分析三系杂交水稻亲本的遗传多样性

【目的】利用功能基因标记分析三系杂交稻亲本的遗传多样性。【方法】利用44个根据文献共同报道的QTL位点或者已经被精细定位或已克隆的与水稻产量性状基因紧密连锁的功能基因标记,以及29个覆盖水稻12条染色体的在三系杂交水稻亲本间多态性高、带型清晰、重复性好的SSR标记分析76个三系杂交水稻亲本的遗传多样性。按POPGEN32分析软件要求将PCR扩增产物的凝胶电泳结果数字化,将数字化的矩阵数据转换为基因型数据,在POPGEN32软件下计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、多态性位点百分率（P）、Nei’s遗传多样性指数（He）,用于评价所有亲本材料的基因多样性;计算遗传分化系数（Fst）、Nei遗传距离（D）,进行遗传结构和遗传关系检测。利用NTSYS-pc2.10e软件计算品种间遗传相似系数（GS）,并根据GS按非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析,绘制品种间遗传聚类树状图。【结果】44个功能基因标记中有37个标记具有多态性,多态性位点百分率（P）84.09%,共检测到86个等位基因位点,平均每个位点2.32个,变化范围2-4个;其中有效等位基因（Ne）62.95个,占73.2%,Nei’s遗传多样性指数（He）变幅为0.049-0.831,平均值0.585。76份材料间的遗传相似系数（GS）变幅为0.323-0.973,平均值0.650。聚类分析表明在遗传相似系数0.618处分为保持系和恢复系两类。保持系和恢复系间的遗传分化系数（Fst）为0.151,属高度遗传分化,Nei遗传距离（GD）0.185,类群内遗传距离相对较小,类群间遗传距离相对较大。29个SSR标记共检测到72个等位基因位点,平均每个位点2.48个,变化范围2-4个;聚类分析表明未能将保持系和恢复系分为两类,部分保持系聚类在了恢复系群,部分恢复系聚类在了保持系群。【结论】相对于普通分子标记,功能基因标记具有较高的DNA多态性检测效率,用于类群划分和种质资源的多样性分析等方面更具准确性和可靠性;三系杂交稻亲本在44个产量功能基因位点的亲缘关系较近,遗传基础狭窄,同源性较高。但保持系群和恢复群系间在这些功能基因位点的遗传差异较大,遗传分化程度较高,杂交水稻骨干亲本在产量性状上仍具有较高的杂种优势利用空间。     

茶树CHS基因结构及编码区单核苷酸多态性分析

【目的】通过试验获得茶树CHS基因（CsCHS）gDNA序列,以进一步确定CsCHS基因结构;研究CsCHS编码区单核苷酸多态性,并结合茶树多酚含量进行关联分析,寻找基因中可能存在的与茶多酚含量存在显著或极显著相关关系的SNP位点。【方法】根据NCBI数据库中已有CsCHS序列设计特异性引物,再分别以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增,经克隆、测序获得CsCHS1、CsCHS2、CsCHS3三个基因的gDNA和cDNA全长序列,通过序列比对方法确定CsCHS结构。利用Compute pI/Mw、SOPMA等软件对所得序列进行生物信息学分析,预测和比较CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白质结构。以茶多酚含量差异较大的57份茶树品种为材料,分别以57份材料的cDNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,然后利用PCR产物直接测序法筛查CsCHS编码区序列的单核苷酸多态性。结合CsCHS编码区序列单核苷酸多态性和57份材料多酚含量,利用软件TASSEL进行关联分析,筛选基因中可能与茶多酚含量存在显著或极显著相关关系的SNP位点。【结果】试验获得CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的cDNA序列长度分别为1 277、1 320和1 242 bp,各自均包含一个长度为1 170 bp的开放阅读框;CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的gDNA序列长度分别为1 600、1 330和1 607 bp。通过gDNA序列和cDAN序列比对,结合真核生物内含子GT-AG法则,确定CsCHS1、CsCHS3分别包含2个外显子和1个内含子,内含子大小分别为323和356 bp,CsCHS2可能没有内含子。根据CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3 cDNA序列推导三者对应氨基酸序列,比较三条氨基酸序列发现三者氨基酸同源性较高,达到92.6%-95.4%,CHS蛋白亚家族中的特征性保守位点在这三条序列中都能找到,生物信息学分析结果显示CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白质结构高度相似。CsCHS1编码区序列中共发现71个SNP位点,SNP出现频率为1SNP/16.48 bp,无Indel,基因核苷酸多样性（π）值为0.01088;CsCHS2编码区序列中共发现55个SNP位点,SNP出现频率分别为1SNP/21.27 bp,CsCHS2核苷酸多样性（π）值（0.00530）明显低于CsCHS1;因扩增CsCHS3 cDNA序列的PCR反应成功率低,未对该基因遗传多样性进行分析。通过关联分析分别从CsCHS1和CsCHS2中找到2个和4个与茶叶多酚含量相关的SNP位点。【结论】CsCHS1和CsCHS3属于保守型CHS基因,且CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3蛋白质结构高度相似,推测三者可能在茶树的不同部位或不同生长阶段发挥类似作用;CsCHS1和CsCHS2活跃,二者编码区内可能存在突变热点区。     

1个新的玉米半透明皱缩胚乳突变体的遗传分析及基因定位

【目的】解析半透明皱缩玉米胚乳形成机制.【方法】以纯合玉米突变体M-E-479为供试材料,通过对M-E-479籽粒进行表型鉴定、遗传分析、主要成分测定及扫描电镜观察,构建定位群体,利用图位克隆技术对突变基因进行遗传定位.【结果和结论】M-E-479突变体胚乳中脂肪含量增加,蛋白质和淀粉含量下降,淀粉粒的大小、形状、排列空间发生改变;用F2群体将突变基因定位在10号染色体SSR标记bnlg1074与umc1506之间,两标记的遗传距离约为3.6 cM,两标记的物理距离约为2.2 Mb.可见M-E-479是一个新的玉米半透明皱缩胚乳突变体,突变性状是由隐性单基因控制.     

犬细小病毒YBYJ株的分离鉴定及VP2基因的序列分析

[目的]为分离犬细小病毒（CPV）.[方法]采集疑似CPV感染病死犬的组织病料,用胎猫肾细胞（F81）进行病毒分离,并对分离的病毒进行回归动物试验、间接免疫荧光（IFA）及VP2基因PCR扩增鉴定.[结果]经盲传3代后FS1出现明显细胞病变（CPE）,分离病毒可导致2～3月龄犬出现典型犬细小病毒病（CP）的临床症状和特征性病理变化,通过IFA观察到特异性的绿色荧光,PCR扩增到VP2基因全长为1 755 bp,编码584个氨基酸.它与国内外具有代表性的18株CPVVP2基因的核苷酸同源性为98.0％ ～ 99.8％,氨基酸同源性为96.1％ ～99.8％.[结论]用F81细胞成功分离到1株强毒CPV,命名为YBYJ株.     

杜氏盐藻基因DsSP的克隆、分析和原核表达(英文)

[目的]克隆盐藻淀粉磷酸化酶基因,并初步分析其基本性质和表达蛋白。[方法]采用RT-PCR和RACE的方法克隆基因;生物信息学系统分析其性质;构建原核表达载PGS21a-DsSP转化于E.coli BL21表达蛋白,采用GST-SefinoseTMKit和Western Blot分别纯化、检测该融合蛋白。[结果]成功克隆出1种淀粉磷酸化酶(GenBank accession No.KF061044)命名为DsSP;分析得到了其基本性质并预测了该蛋白的亚细胞定位、二级结构和三级结构;该融合蛋白在上清和包涵体中均存在,且对上清蛋白成功纯化;Western Blot检测表明其在E.coli.BL21中成功表达。[结论]为进一步阐明DsSP的功能及作用机制奠定了理论基础。     

广西罗非鱼和卵形鲳鲹海豚链球菌的生化特性及基因多态性分析

对2006-2011年从广西养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus和卵形鲳鲹Trachinotus ovatus中分离的链球菌菌株进行生理生化和二重PCR鉴定,并利用随机扩增多态性DNA标记( RAPD)对经鉴定为海豚链球菌Streptococcus iniae的临床菌株进行生化特性及基因多态性分析。结果表明：经鉴定共有22株临床分离菌株为海豚链球菌; RAPD分析发现,所有菌株的电泳结果均在750 bp处出现特异性条带,且带型相同;结合Bachrach的研究结果,推测本试验中所分离的22株海豚链球菌的血清型均为Ⅰ型。本研究结果可为防治鱼类海豚链球菌病提供科学依据。