Establishment of Digital RT-PCR Assay for Detection of Swine Influenza Virus H3N2 Subtype

A new assay for the detection of swine influenza virus (SIV) was developed with a novel nucleic acid probe——Molecular beacon in this study. The specific primers and molecular beacon probes were designed according to the conserved region of H3 and N2 genes of SIV H3N2 subtype. A digital RT-PCR assay was developed for detection of SIV H3N2 subtype. The results showed that SIV H3N2 subtype could be identified simultaneously on this microarry with high sensitivity and reproducibility,which could reach to 10⁶ dilute viruse. The conclusion was that the digital RT-PCR method could analyze quantitatively the RNA templates.On the identification of H3N2 SIV,the digital RT-PCR method was much more scientific than Real-time quantitative PCR method.     

H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法的建立及初步应用

虽然H3、H9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是低致病性禽流感病毒,但其具有跨宿主感染哺乳动物的能力,对社会公共卫生安全具有重大的潜在危害,因而对这些亚型病毒的监测极其重要。通过比对GenBank上H3、H9亚型禽流感病毒HA基因序列,设计了分别针对H3 AIV和H9 AIV的特异性探针。特异性试验和标准曲线试验的结果显示,这两个探针仅分别特异性识别H3、H9亚型AIV,且具有较好的扩增效率。通过重组质粒pMD19-T-H3HA和pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板,进行敏感性实验。结果表明,本研究所建立的荧光定量PCR方法能检测到100个DNA拷贝数H3 AIV和10个DNA拷贝数的H9 AIV,比传统PCR方法敏感性分别提高了100倍和1000倍。此外,本方法还能检测到10 EID50的H3亚型AIV或H9亚型AIV,比传统PCR方法检测敏感性均提高了1000倍。批间和批内试验的变异系数均小于3%,表明本研究建立的方法具有较好的重复性。此外,与传统PCR方法相比,用H3、H9亚型AIV双重荧光定量PCR方法检测人工感染动物的肺组织时,针对H3 AIV的敏感性提高了10~100倍,针对H9 AIV的敏感性提高了100倍。综上所述,本研究所建立的H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法具有较高的特异性和敏感性,对H3、H9亚型禽流感病毒监测具有重要的应用价值。     

地理远缘紫花苜蓿品种间杂交后代性状变异分析

以紫花苜蓿杂交组合（云南德钦地区紫花苜蓿为母本,引进紫花苜蓿品种Acrora为父本）的杂交亲本、杂种一代、杂种二代为研究材料,对供试材料的植株高度、分枝数、叶片长宽、干重等的变异幅度和变异规律进行了分析,旨在探索地理远缘的紫花苜蓿材料间杂交后代的性状变异及其规律,为选育出适合云南地区种植的紫花苜蓿品种提供基础。结果表明：F2的叶形性状发生了分离,出现了多叶性状的变异体。与杂交亲本相比,杂种后代表型性状出现了较大的变异,且各性状间变异幅度存在一定的差异,F1的株高,F2的叶长、宽出现了超均优势。在杂种后代中,5个性状的变异系数从大到小依次为干重〉分枝数〉株高〉叶长〉叶宽。     

猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。结果,该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性,而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝/μL。对37份现地病料的检测结果也表明该法(检出17份)比常规RT-PCR方法(检出12份)和TGEV抗原快速检测试剂盒(免疫层析法,检出10份)的敏感性高。     

荧光定量PCR技术及其应用研究进展

荧光定量PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR技术的有机结合,而荧光探针是荧光定量PCR的核心.荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应争特点,是对原有PCR技术的革新,扩大了PCR的应用范围.论文综述了FQ-PCR技术的原理、FQ-PCR实时定量检测系统及其应用.     

H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,并制作标准曲线,建立了检测H3亚型猪流感的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为13.68,18.21和20.57;变异系数分别为0.31%、0.17%和0.12%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.     

Non-iterative variance component estimation in QTL analysis

In variance component quantitative trait loci (QTL) analysis, a mixed model is used to detect the most likely chromosome position of a QTL. The putative QTL is included as a random effect and a method is needed to estimate the QTL variance. The standard estimation method used is an iterative method based on the restricted maximum likelihood (REML). In this paper, we present a novel non-iterative variance component estimation method. This method is based on Henderson's method 3, but relaxes the condition of unbiasedness. Two similar estimators were compared, which were developed from two different partitions of the sum of squares in Henderson's method 3. The approach was compared with REML on data from a European wild boar × domestic pig intercross. A meat quality trait was studied on chromosome 6 where a functional gene was known to be located. Both partitions resulted in estimated QTL variances close to the REML estimates. From the non-iterative estimates, we could also compute good approximations of the likelihood ratio curve on the studied chromosome.     

辽宁地区樗蚕的生物学特性及人工饲育技术研究

樗蚕(Samia cynthia Walker et Felde)是一种珍贵的泌丝及食用昆虫资源。通过室内及野外人工饲育的方法,观察分布在辽宁地区的樗蚕的形态特征和生活习性,发现与分布于其它地区的樗蚕存在不同程度的差异。辽宁地区的樗蚕年发生1-2代,喜食臭椿(Ailanthus altissima)、山花椒(Zanthoxylum schinifollum)、枣树(Zizyphus jujube)、黄檗(Phellodendron amu-rense)等的树叶,幼虫4眠5龄,龄期经过25-37d,饲料种类不同可造成龄期差异;以蛹滞育。人工饲育樗蚕可采用小蚕室内育,大蚕野外育的饲养形式;种茧保护可采用柞蚕(Antheraea pernyi)的种茧越冬保护技术与方法,春季种茧出库后在温度20～23℃、相对湿度75%～85%的条件下暖茧,成虫交配时间超过4h的卵孵化率较高;樗蚕的主要病害有细菌性软化病、白僵病、微粒子病,春、秋季野外饲养的樗蚕易被蚕饰腹寄蝇(Blepharip azebina)寄生危害。樗蚕茧丝的纤度为1.80～3.60dtex,茧层丝胶练减率平均为25%,茧丝中的丝素蛋白约78%。