猪繁殖与呼吸综合征病毒FS株Nsp9基因的克隆与序列分析

为了对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp9基因的功能进行预测,利用RT-PCR法从细胞毒中扩增PRRSV FS株的Nsp9基因,并将其克隆至pMD18-T载体上,测序得到Nsp9基因序列,利用多种生物信息学软件分析Nsp9序列生物学信息。结果显示,Nsp9基因全长1 929 bp,目的基因的蛋白分子质量为70.5 ku,pI为7.78,表明该蛋白不稳定;抗原性分析显示,Nsp9基因存在多个抗原位点,柔韧性较好,多处位点的亲水性较强,适合作为单抗制备的表位;同种亚型不同毒株的Nsp9基因氨基酸同源性为96.9%～98.9%,这表明Nsp9基因高度保守,可进一步作为检测靶蛋白用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的诊断与疫苗免疫;亚细胞定位预测该基因可能定位于细胞质中,而不是细胞核内;同源建模预测三级结构结果显示,三维结构呈右手型,具有3个亚结构域,没有信号肽。此外,亲本株Nsp9基因与疫苗株Nsp9基因存在多个氨基酸的突变,这些氨基酸的插入与缺失是否与病毒的聚合酶活性和毒力有关还需要进一步试验验证。     

PRRSV野毒感染猪群免疫接种弱毒活疫苗的效果分析

为评估猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）弱毒活疫苗的免疫效果,本研究在两个小型猪场各选取两窝仔猪,在免疫接种猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）弱毒活疫苗后不同时间采集血清,应用RT-PCR检测PRRSV核酸,应用N-ELISA和G-ELISA两种试剂盒检测PRRSV抗体。结果发现,免疫前0 d可以从仔猪血清中检测到PRRSV野毒株核酸,可持续到免疫后30 d;相对应的母猪在免疫前0 d可从血清中检测到PRRSV野毒株核酸。试验仔猪在免疫前0 d未能检测到PRRSV抗体,但在免疫后30～150 d均可检测到PRRSV抗体,其中N-ELISA试剂盒的阳性检出率在免疫后30、60 d高于G-ELISA试剂盒的阳性检出率,而在免疫后120、150 d则低于G-ELISA试剂盒的阳性检出率。使用两种ELISA试剂盒共同检测216份血清样品,检测结果的总体符合率为95.83%;配对χ²检验,P>0.05,两者差异不显著;Kappa值为0.87,属于极强一致性;两者相关系数r为0.605,具有显著线性相关。表明免疫接种弱毒活疫苗可以有效清除野毒感染猪群中的野毒株,N-ELISA和G-ELISA两种ELISA试剂盒均可用于评估弱毒活疫苗的免疫效果。     

猪流行性腹泻病毒与猪伪狂犬病病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪伪狂犬病病毒（PRV）的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank已登录的PEDV膜蛋白M基因和PRV gE基因保守区域序列设计了2对特异性引物,以PRV和PEDV混合总RNA为反转录模板,初步建立了PRV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性验证和临床应用检测。结果显示,该方法对两种病毒的最低检测限均为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增PEDV和PRV细胞培养物,但对其他7种病原对照扩增不出任何条带,对26份临床疑似PEDV和PRV感染样品检测结果与测序鉴定结果完全一致。本研究成功建立了PEDV和PRV的二重RT-PCR检测方法,为临床上猪流行性腹泻和猪伪狂犬病的快速鉴别诊断提供了方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV N蛋白,亲和层析纯化后作为包被抗原,通过对各反应条件优化选择,建立了PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法,并进行了交叉反应和重复性试验,以及同类成品试剂盒间的应用效果对比试验。最终确定了抗原包被最佳浓度为2 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,血清及酶标二抗孵育时间均为30 min,显色时间为10 min,检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒等5种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该ELISA检测方法批内和批间重复性的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒效果比较显示符合率为94.7%。本研究建立的间接ELISA方法将为猪群感染野毒PRRSV后的快速诊断及流行病学调查提供一种简便易行、快速高效的血清学抗体检测方法。     

不同佐剂对猪圆环病毒衣壳蛋白免疫原性的影响

试验旨在研究猪圆环病毒不同佐剂疫苗的制备及其对免疫原性的影响。将去除信号肽的PCV2（porcine circovirus type 2,PCV2）Cap蛋白基因连接在pET-28a载体上,进行诱导表达,用脱氧胆酸钠（DOC）和低浓度尿素对表达产物进行溶解,制备氢氧化铝胶体佐剂、脂质体佐剂、弗氏佐剂、白油佐剂、蜂胶佐剂,并与纯化的PCV2-Cap蛋白混合制成亚单位疫苗,以商品化的灭活疫苗作为阳性对照,免疫小鼠,并使用ELISA方法检测动物血清中抗体及细胞因子含量的变化,评估其免疫保护效果。结果显示,表达产物以包涵体的形式存在,使用DOC溶解包涵体可省略蛋白复性步骤,且纯化方法简单,获得纯度较高的衣壳蛋白;ELISA检测结果表明PCV2-Cap蛋白能诱导产生特异性较高的抗体;水系佐剂制备的亚单位疫苗具有较高的免疫活性,为亚单位疫苗的商品化提供重要的数据支持。     

冀鲁豫交接地区不同规模猪场高致病性猪蓝耳病血清学调查

为了解冀鲁豫三省交接地区不同规模猪场高致病性猪蓝耳病免疫抗体水平情况,为高致病性蓝耳病强免工作提供数据支持。2012—2014年3年间,通过ELISA方法对冀鲁豫三省交接地区不同猪场的2 829份血清进行高致病性蓝耳病抗体水平检测。结果显示,不同饲养阶段、不同养殖规模、不同年份猪的免疫抗体水平均存在一定差异。这说明这一地区猪群还有待加强定期抗体检测和高致病性猪蓝耳病疫苗免疫。     

四川省腹泻病猪的猪萨佩罗病毒检测及1B基因序列比较分析

为了解猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)的流行及变异情况,采集2015-2016年四川地区12个县市34个猪场共计428份腹泻病料,采用QRT-PCR方法对PSV进行检测。结果显示:在428份病料中,共有114份为PSV阳性,阳性率为26.6%;所检测的34个猪场中,共有20个猪场显示PSV阳性,猪场阳性率为58.8%,表明PSV在四川地区普遍存在。此外,对来自不同县市共14份PSV阳性病料1B全基因进行PCR扩增,通过分子克隆,测序,再利用序列分析软件对四川部分地区猪萨佩罗病毒1B基因进行序列分析。结果表明,14条猪萨佩罗病毒1B基因核苷酸序列及推导出的氨基酸序列相似性分别为90.6%~100%和97.1%~100%。遗传进化分析显示,该研究获得的四川株与已知中国株分属于一个大的分支,说明我国猪萨佩罗病毒1B基因序列较为保守,没有发生大的基因变异。所有中国分离株与韩国株、德国株、英国株处在不同分支,又说明我国PSV的流行毒株可能存在独立进化。     

不同油菜品种内源激素水平的差异及其对催熟剂的响应

为了研究催熟剂对油菜内源激素的影响,以促进果粒的一致成熟和适应机械化收割,以4种不同熟期的油菜品种和复合催熟剂（0.5%乙烯利+0.3%敌草快）为材料,研究不同熟期油菜品种内源激素的差异及催熟剂对不同品种内源激素的影响。结果表明：成熟期不同品种油菜内源激素含量差异显著,早熟品种的乙烯、ABA含量高于晚熟品种,且高峰期出现较早,下降也较快;而IAA含量与乙烯、ABA含量相反。喷施催熟剂后,乙烯与ABA含量增加,IAA含量降低;角果皮中乙烯释放增加量显著大于籽粒,晚熟品种表现更持久,ABA含量的增加规律与之相反;角果皮与籽粒中IAA的下降幅度在不同品种间表现不同。推测催熟剂可以通过调节内源激素的释放量来促进油菜籽粒成熟。     

猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的抗氧化活性研究

以猪骨蛋白酶解液和葡萄糖（或木糖）为原料,100 ℃水浴加热120 min以制备美拉德反应产物,采用超滤分离产物获得不同分子量范围（<1、1～5、5～10、>10 ku）的组分,研究各分离组分的体外抗氧化活性。结果表明,不同组分均具有一定的抗氧化活性,其中分子量>10 ku的组分具有较高的DPPH自由基清除能力、还原能力以及Fe2+螯合活性,表明高分子量美拉德反应产物的抗氧化能力更强。葡萄糖、木糖组产物的自由基清除能力、还原能力以及Fe2+螯合活性差异均不显著（P＞005）,说明还原糖结构对该研究制备的美拉德反应产物的抗氧化活性未产生明显影响。     

G418处理核供体细胞对猪克隆胚胎体外发育效率的影响

【目的】探索G418处理供体细胞对其核移植胚胎发育效率的影响。【方法】利用G418单独处理猪成体成纤维细胞6 d后,收集细胞,利用荧光定量PCR的方法检测处理前后细胞中抗氧化应激、细胞凋亡相关基因的表达水平,运用亚硫酸盐结合测序法分别检测基因组重复序列LINE-1、微卫星的DNA甲基化状态,以及其核移植胚胎体外发育的能力。【结果】经不同质量浓度G418处理的供体细胞的抗氧化应激酶相关基因及细胞凋亡基因表达发生显著变化(P0.05),但其DNA甲基化水平没有发生改变(P0.05);经G418处理的供体细胞的核移植胚胎的体外发育效率显著低于对照组(P0.05)。【结论】G418处理供体细胞可能对其克隆胚胎体外发育效率有抑制作用。