猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3．1-pIL-18为模板，采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18（IL-18）的成熟蛋白基因，通过KpnⅠ＋SacⅠ双酶切及连接反应，构建了pET32c—pIL—18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实，重组质粒中的基因片段连接正确。之后，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃、1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子质量约为33ku处出现了预期的目的蛋白。用8mol／L脲对表达产物变性，经Ni^2＋NTA柱纯化，透析复性，得到了纯化的IL-18蛋白。Western—blot分析证实，纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪microRNA的初步筛选

本试验旨在初步筛选出与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染相关的猪microRNA(miRNA)。采用生物信息学方法预测可能与PRRSV 3′非编码区(3′utr)产生相互作用的猪miRNA,构建PRRSV 3′utr的双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK-utr,同时合成预测到的miRNA(ssc-miR-323、ssc-miR-105-1)及其相应的抑制物,共转染猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC),检测双荧光素酶活性。结果发现,ssc-miR-323与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率略有升高,ssc-miR-105-1与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率降低。初步判定ssc-miR-323对PRRSV 3′utr没有抑制作用,而ssc-miR-105-1对PRRSV3′utr有一定的抑制作用。     

种公猪精液中猪瘟和蓝耳病病毒混合感染的快速检测

参考GenBank公布的猪蓝耳病病毒(PRRSV)VL2332株、LV株以及猪瘟兔化弱毒(CSFV)C株的基因序列,各设计合成了一对引物,建立了在相同PCR扩增条件下能同时检测PRRSV和CSFV的RT-PCR方法。对2003~2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的17个大中型猪场送检的186份种公猪精液进行了检测,结果18份呈PRRSV阳性,24份呈CSFV阳性,其中有11份为PRRSV和CSFV的混合感染,约占送检精液样品的5.91%。试验结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于精液中这2种野毒感染的快速鉴定和分子流行病学调查。     

猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究

PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3．1（＋），构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，命名为pCORF2BVP22和pCBVP220RF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠，分别注射pCDNA3．1（＋）、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP220RF2，共免疫2次，间隔2周，分别于首免后2周和二免后4周采血，ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达，将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体，构建了pNORF2和pNBVP22，转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示，通过两次免疫后，各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体，同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）早期检测方法,本研究利用逆转录环介导恒温扩增技术（RT-LAMP）,针对PRRSV的ORF5基因片段设计了4条引物,利用Bst DNA聚合酶在65 ℃恒温条件下进行逆转录扩增,通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和加入SYBR Green Ⅰ染料肉眼判断结果,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。结果表明,该检测方法具有良好的特异性,与其他常见病毒如猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒等无交叉反应,较普通RT-PCR灵敏性高100倍。采用RT-LAMP和RT-PCR分别对10份临床样本同时进行检测,符合率为100%。因此,本研究建立的RT-LAMP是一种可适用于临床PRRSV检测的快速、简单、灵敏、特异的检测方法。     

小檗碱和川芎嗪对猪卵母细胞体外成熟中一氧化氮生成量的影响

试验以mTCM-199添加抗生素为对照组,以分别添加0.1μg/mL小檗碱(berberine,BR)和0.5μg/mL川芎嗪(ligustrazine,Lig)为试验组,比较各组卵母细胞体外成熟中一氧化氮(NO)生成量和卵母细胞的成熟效果,从而探讨中药单体成分对猪卵母细胞体外成熟过程中NO生成量的影响。结果表明:体外成熟前22 hNO生成量,对照组与Lig组差异极显著(P<0.01)、与BR组差异显著(P<0.05),Lig组与BR组差异显著(P<0.05);体外成熟后22 h NO生成量,对照、Lig及BR三组间均无显著差异(P>0.05),但Lig组的NO生成量少于BR组和对照组;体外成熟培养0～44 h不同组别NO生成量整体呈下降趋势,Lig组与BR组卵母细胞成熟率显著高于对照组(P<0.05)。结果表明卵母细胞体外成熟培养过程中,NO生成量随体外培养时间增加呈递减趋势,中药单体成分BR和Lig对卵母细胞成熟均起到一定的促进作用。低浓度NO代谢量可能对卵母细胞成熟有一定促进作用。     

畜禽内源氨基酸代谢及测定方法学研究进展

内源氨基酸的排泄量是计算饲料真可消化率以及析因法估计动物蛋白质、氨基酸需要量的重要参数。本文综述了近年来内源氨基酸代谢以及测定方法学的国内外研究进展,特别是我国科技工作者在准确测定动物内源氨基酸代谢方面的研究成果。     

上海PMWS并发PRRS自然病例的病理组织学观察

对上海5例5～13周龄断奶仔猪多器官衰竭综合征（PMWS）并发猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）自然病例进行了病理组织学观察。结果：5例病猪均出现坏死性淋巴结炎、间质性肺炎以及不同程度的坏死性脾炎、间质性肾炎和肝炎。2例病猪出现心肌炎，表现为心肌纤维断裂、溶解和心肌间质中淋巴细胞局灶性浸润。2例病猪出现脑炎，在大脑白质区出现神经胶质细胞结节。     

2009-2010年云南部分猪场猪主要传染病血清流行病调查

为了探查2009-2010年云南部分猪场对猪主要传染病疫苗接种后的免疫效果,本试验主要通过ELISA方法对样品进行血清流行病调查。结果表明,猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)抗体阳性率为84.33%(1211/1436);猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体阳性率为74.84%(803/1073);猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)抗体阳性率为0.00%(0/80);猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)抗体阳性率为62.26%(287/461);猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)抗体阳性率为54.25%(83/153);日本乙型脑炎抗体阳性率为63.33%(76/120)。提高PRRSV、PRV、PPV和乙脑疫苗的使用效果是云南省内猪场解决母猪流产的有效途径。