植原体病害研究概况

植原体原名类菌原体,是一类重要的植物病原物,归属于细菌,无细胞壁,专性寄生于植物韧皮部。在菌体大小、结构以及遗传进化上与菌原体、螺原体十分相似。世界范围内植原体已引起千余种植物病害,主要表现为丛枝、黄化、节间缩短等。植原体病原主要依靠吸食植物韧皮部的昆虫介体传播,如叶蝉、木虱等。本文主要对植原体的病原学、遗传进化与基因组、致病机理以及防控进行综述。     

小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白（Imp）基因的克隆和分子特性分析

 【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp 1051/Imp 2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因的同源矩阵、系统发育树分析;对克隆基因所编码蛋白进行跨膜区、亲疏水区和前导信号序列分析。【结果】从小麦蓝矮病病株和接种长春花中均扩增到约1.0 kb的特异片段,其中小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因长495 bp,推导的编码蛋白含有164个氨基酸。与10种植原体的免疫膜蛋白基因进行序列同源性分析,小麦蓝矮与三叶草绿变植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列的同源率分别为98.4％和95.1％。蛋白质结构分析结果表明：小麦蓝矮免疫膜蛋白N端有一个跨膜的前导信号序列,C端为跨膜锚定区,中间为膜外亲水区。【结论】小麦蓝矮植原体与三叶草绿变、翠菊黄化、洋葱黄化和泡桐丛枝植原体的免疫膜蛋白为同型蛋白。     

枣树植原体快速PCR检测体系研究

依据已获得的16S rDNA序列,通过BLAST和DNAman软件分析其同源性,找到其保守序列,并设计出NTF1/NTR1、NTF2/NTR1、NTF3/NTR1、NTF1/NTR2、NTF2/NTR2、NTF3/NTR2共5对引物序列,通过优化,筛选出了适宜的PCR检测体系,通过检测验证,该体系能很好地应用于枣疯病植原体的检测。利用优化的检测体系对新疆部分样品进行检测,发现灰枣品种的个别样品携带植原体。     

我国部分枣树品种(系)的枣疯病抗性鉴定

收集了我国部分地区的不同枣树品种(系)的休眠期健康接穗材料,于2009年和2010年的4-6月嫁接到枣疯病砧木上,定期检查接穗发病状况,并采用PCR技术检测植原体感染.结果显示,不同枣树品种对枣疯病的抗性差异明显,根据接穗发病早晚、症状轻重、发病率和病情指数,将测定品种分为5个类型,其中高度抗病品系2个、中度抗病品系4个、一般抗病品系15个、感病品系7个、高度感病品系6个.高抗品系(交城骏枣、唐县和太原壶瓶枣)嫁接当年萌生枝条枣疯病无明显症状或嫁接早期无症状,后期症状较轻.嫁接到病树遮阴部位的接穗发病程度要重于向阳部位;存放期长和嫁接时间早的接穗,易诱发抗性品系发病.巢式PCR能检测到无症抗病接穗内低浓度植原体侵染.与以往所采用的昆虫自然传染和病皮或病枝嫁接到待鉴定的砧木品系上鉴定抗性技术相比,该方法具有接种强度大、诱导发病快、测定方法简便等优点,但对一般抗性、整株或成年株抗性、抗介体传毒等类型的抗性鉴定有局限性.     

泡桐丛枝植原体pPaWBNy-2-ORF4编码蛋白的抗体制备和表达分析

以感病泡桐组培苗提取的DNA为模板,采用PCR方法扩增pPaWBNy-2-ORF4的部分片段.将目的片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-3,重组质粒pGEX-p2ORF4转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株.IPTG诱导表达,分子量约为38 kDa的含GST标签的融合蛋白得到表达.切胶回收目的蛋白,免疫大白兔制备抗血清.间接ELISA测定抗血清的效价约为1:4096,免疫印迹实验显示:抗血清能够与原核表达的GST融合蛋白发生特异的免疫反应,与pPaWBNy-1-ORF5的原核表达蛋白无明显的交叉反应.利用制备的抗血清,在感病泡桐饲毒的茶翅蝽中检测到分子量约为18 kDa的蛋白条带,而在无菌茶翅蝽和感病泡桐组培苗中均未检测到,表明pPaWBNy-2-ORF4在饲毒的茶翅蝽中表达,而在感病泡桐组培苗中未表达或表达量低于检测水平.据此推测,该基因参与茶翅蝽传播泡桐丛枝植原体.     

金莲花绿变植原体的分子鉴定

本研究对河北省大面积发生的金莲花绿变病的病原进行检测和鉴定。以金莲花叶片的总DNA为模板,使用植原体16S rDNA和核糖体蛋白(ribosomal protein)基因rp的特异性引物进行PCR扩增,在感病金莲花样品中扩增到植原体的16S rDNA(1 432 bp)片段和rp基因(1 240 bp)片段。序列分析发现,获得的16S rDNA和rp基因片段与洋葱黄化植原体Onion yellows phytoplasma(GenBank登录号:AP006628)的相似度最高,分别为99.9%和99.3%,确定金莲花绿变病的病原为植原体,暂命名为金莲花绿变植原体Trollius chinensis virescence phytoplasma。对金莲花绿变植原体的16S rDNA进行虚拟RFLP分析,发现其酶切图谱与16SrⅠ-B亚组的洋葱黄化植原体的参照图谱完全一致,相似系数1.00。16S rDNA和rp基因的系统发育进化树显示,金莲花绿变植原体与16SrⅠ-B亚组的植原体聚为一支,属于植原体16S rⅠ-B亚组。     

Activity of benzothiadiazole on chrysanthemum yellows phytoplasma (‘Candidatus Phytoplasma asteris’) infection in daisy plants

A commercial preparation of the plant resistance elicitor benzothiadiazole (BTH) (Bion, Syngenta Crop Protection) was tested for its capacity to induce systemic resistance against chrysanthemum yellow phytoplasma (CYP) infection in the Chrysanthemum carinatum plant. Following one 2.4 mM BTH application, plants were exposed to CYP-infective Macrosteles quadripunctulatus leafhoppers. Symptom development and phytoplasma multiplication in the test plants were measured over time. BTH application delayed symptom development and phytoplasma multiplication in treated plants compared with the control ones. CYP titre and symptom severity were significantly lower for the first two weeks post-inoculation in treated plants compared with the control ones, suggesting that systemic acquired resistance (SAR) induced by BTH in C. carinatum is temporary. Higher concentrations of BTH resulted in phytotoxic effects involving the whitening of apical leaves. BTH application was ineffective in reducing the transmission efficiency of CYP by its leafhopper vector. Actually, in both single and group transmission tests, the proportion of infected plants was similar among BTH-treated and untreated plants. The survival of M. quadripunctulatus was unaffected by feeding on BTH-treated daisy plants. Moreover, when leafhoppers were allowed to choose between treated and untreated plants, they showed no preference. We conclude that SAR induced in daisy plants by BTH has no detrimental effects on the vector leafhopper. If the activity of BTH against phytoplasmas is confirmed also on other phytoplasma/host–plant associations, BTH applications might be included in new, more environmentally friendly, integrated management strategies of phytoplasmoses.     

小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白(Imp)的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达

根据跨膜区预测结果,设计ImpF1/ImpR1和ImpF2/ImpR2两对特异性引物。以ImpF1/ImpR1,ImpF1/ImpR2,Imp-F2/ImpR1和ImpF2/ImpR2共4个组合经PCR扩增得到4个目标片段,即:免疫膜蛋白Imp基因的全长(Imp-B);切除C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-N);切除N-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-C);切除N-和C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)。经酶切连接到原核表达载体Pmal-c2x,并转入E.coliBL21(DE3)PlysS菌株中。SDS-PAGE电泳验证,只有切除N-、C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)得到大量表达,结果表明:小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达。根据跨膜区预测结果,设计ImpF1/ImpR1和ImpF2/ImpR2两对特异性引物。以ImpF1/ImpR1,ImpF1/ImpR2,Imp-F2/ImpR1和ImpF2/ImpR2共4个组合经PCR扩增得到4个目标片段,即:免疫膜蛋白Imp基因的全长(Imp-B);切除C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-N);切除N-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-C);切除N-和C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)。经酶切连接到原核表达载体Pmal-c2x,并转入E.coliBL21(DE3)PlysS菌株中。SDS-PAGE电泳验证,只有切除N-、C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)得到大量表达,结果表明:小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达。     

小麦蓝矮病植原体FrvX基因的克隆及致病性测定

【目的】克隆小麦蓝矮病(WBD)植原体β-1,4-内切葡聚糖酶基因(FrvX),验证其在植原体侵染寄主中的作用,为更好地防控小麦蓝矮病奠定理论基础。【方法】采用PCR技术从小麦WBD植原体中扩增到FrvX全基因,将其插入到病毒载体pgR107中,构建重组病毒载体pgR107-FrvX,用农杆菌介导法侵染本氏烟草,观察烟草表型的变化。【结果】FrvX基因全长1071bp,编码356个氨基酸。重组病毒载体接种烟草22d后,有9株烟草植株表现出明显的花叶、黄化症状,RT-PCR检测到发病植株接种7d后的叶片有FrvX基因的转录。【结论】FrvX基因接种烟草导致烟草表型发生变化,推测其与植原体病害的发生有关。     

榆树黄化病植原体的分子检测与鉴定

 利用植原体16SrRNA基因的通用引物R16rrLF2/R16mR1和R16F2n/R16R2对山东泰山上发生的榆树(Ulmus parvifolia)黄化病感病植株总DNA进行巢式PCR扩增,得到了约1.2kb的特异性片段,从分子水平证实了榆树黄化病的病原(EY-China)为植原体。将扩增到的片段测序,并进行一致性和系统进化树分析。结果表明,该分离物属于植原体榆树黄化组(Candidatus Phytoplasma ulmi),与该组成员16SrRNA序列的一致性均在98.2%以上,其中与16SrV-B亚组中的纸桑丛枝(Paper mulberry wiches'-broom)和枣疯病(Jujube witches'-broom)植原体一致性最高,达到99.4%,在系统进化树中与该亚组成员聚类到同一个分支,说明该分离物属于植原体16SrV-B亚组。本研究首次对在中国引致榆树黄化病的植原体进行了分子检测,并通过核酸序列分析将其鉴定到亚组水平。