线粒体DNA在先天性免疫中的作用

线粒体是细胞内重要的细胞器,具有多种功能,是细胞的能量工厂。线粒体含有自己的遗传物质线粒体DNA,线粒体DNA因其在氧化磷酸化中的作用而广为人知。近年来,越来越多的研究表明线粒体DNA可作为先天性免疫系统的激动剂,并在病原体感染和炎性疾病的病理发展中起重要作用。线粒体DNA在进入细胞质或细胞外环境后,可以激活多种先天性免疫系统的模式识别受体,从而触发促炎细胞因子分泌和Ⅰ型干扰素反应。因此,本文就线粒体DNA激活先天性免疫的机制以及其在病原体感染和相关疾病发生发展中的作用进行讨论、总结,以期为进一步深入开展线粒体DNA在病原体感染及相关疾病中的作用及其机制研究提供理论依据。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

携带猪流行性腹泻病毒S1抗原表位的乙肝核心抗原病毒样颗粒的构建与鉴定

旨在构建以乙肝核心抗原（HBcAg）为载体呈现猪流行性腹泻病毒（PEDV）S1抗原表位的病毒样颗粒。将PEDV S1蛋白中含B细胞表位的270 bp片段插入到HBcAg主要免疫显性区域（MIR）,构建重组质粒pET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1,转化到感受态细胞BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定纯化后的重组蛋白,通过透射电镜观察其形态结构。结果显示,成功构建重组质粒pET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1,并在BL21（DE3）中以包涵体形式表达,纯化、复性后的重组蛋白经过2%磷钨酸负染后透射电子显微镜检测到病毒样颗粒结构。HBcAg-PEDV S1重组蛋白能够自发形成病毒样颗粒,在原核表达中,乙肝核心抗原可作为载体呈现PEDV S1抗原表位,为今后新型PED疫苗的研究提供了思路。     

Fas对镉激活PC12细胞线粒体凋亡通路的影响

旨在探究死亡受体Fas在镉致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）凋亡中的作用及其对线粒体通路的调控机制,用10 μmol·L^-1镉处理Fas基因沉默的PC12细胞株12 h,通过Western blot检测BH3相互作用域死亡激动剂（BID）、半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）的活化情况,Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）、凋亡诱导因子（AIF）、核酸内切酶G（Endo G）的表达情况,以及细胞色素C（Cyt C）在细胞内的分布情况,免疫荧光染色检测AIF核转位。结果显示,镉极显著上调tBID/BID比值和Bax/Bcl-2比值,诱导Cyt C从线粒体释放到细胞质,激活caspase-9、caspase-3和PARP,增加AIF和Endo G蛋白表达水平（P<0.01）,并诱导AIF核转位;沉默Fas极显著抑制镉引起的tBID/BID比值和Bax/Bcl-2比值升高,Cyt C从线粒体释放到胞浆,caspase-3、PARP蛋白活化和AIF、Endo G蛋白表达水平极显著升高（P<0.01）,显著抑制镉激活的caspase-9（P<0.05）,并抑制AIF核转位。综上表明,Fas通过调控线粒体通路参与镉致PC12细胞凋亡。     

感染16型蓝舌病病毒后绵羊部分细胞因子消长特点研究

本试验旨在探明绵羊感染16型蓝舌病病毒（Bluetongue virus type 16,BTV16）后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的消长特点。用实时荧光定量PCR检测方法对感染BTV16后3只绵羊上述4种因子mRNA进行检测,同时设立阴性对照绵羊,并以0 d mRNA为基准,计算mRNA的相对表达量,同时检测病毒抗体效价、测量绵羊体温。结果显示,接种BTV16的3只绵羊均不同程度产生抗体和体温症状,4种细胞因子的mRNA在接种病毒2~4 d内均出现显著上升,其中IFN-γ峰值在2.58~27.84倍之间,IL-2峰值在5.24~17.19倍之间,IL-4峰值在2.16~3.43倍之间,IL-10峰值在15.78~48.77倍之间,个体上升幅度存在显著差异,4种细胞因子均在高水平持续6 d左右后逐渐下降。对照绵羊上述参数在正常范围内波动。本研究阐明了接种BTV16后绵羊细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10在转录水平上的消长特点,为进一步深入开展BTV感染特征、宿主机体免疫机制研究提供参考。     

Phylogenetic analysis of Myanmar indigenous chickens using mitochondrial D-loop sequence reveals their characteristics as a genetic resource

Myanmar indigenous chickens play important roles in food, entertainment, and farm business for the people of Myanmar. In this study, complete mitochondrial D-loop sequences (1232 bp) were analyzed using 176 chickens, including three indigenous breeds, two fighting cock populations, and three indigenous populations to elucidate genetic diversity and accomplish a phylogenetic analysis of Myanmar indigenous chickens. The average haplotype and nucleotide diversities were 0.948 ± 0.009 and 0.00814 ± 0.00024, respectively, exhibiting high genetic diversity of Myanmar indigenous chickens. Sixty-four haplotypes were classified as seven haplogroups, with the majority being haplogroup F. The breeds and populations except Inbinwa had multiple maternal haplogroups, suggesting that they experienced no recent purifying selection and bottleneck events. All breeds and populations examined shared haplogroup F. When 232 sequences belonging to haplogroup F (79 from Myanmar and 153 deposited sequences from other Asian countries/region) were analyzed together, the highest genetic diversity was observed in Myanmar indigenous chickens. Furthermore, Myanmar indigenous chickens and red junglefowls were observed in the center of the star-like median-joining network of 37 F-haplotypes, suggesting that Myanmar is one of the origins of haplogroup F. These findings revealed the unique genetic characteristic of Myanmar indigenous chickens as important genetic resources.     

1株奶牛源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

为确定奶牛垫料中是否含有病原菌并深入了解垫料中优势生长菌的类型、耐药性及致病性等情况,本试验进行了细菌分离培养、革兰染色镜检、生化试验鉴定、16S rDNA序列分析及同源性比对、药敏试验、小鼠致病性试验。结果显示,分离菌在普通营养琼脂平板上形成圆形、表面光滑的白色菌落,血琼脂平板上形成黏稠、较大的白色菌落。革兰染色镜检结果显示,分离菌为革兰阳性,球型,呈葡萄串状排列,或单个散落。生化试验结果显示,分离菌对木糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、硝酸盐还原等呈阳性反应,而蜜二糖、木糖醇、山梨醇、尿素、V-P反应等呈阴性反应。16S rDNA序列分析结果显示,扩增的16S rDNA序列长度为1 298 bp,与松鼠葡萄球菌的核苷酸同源性达99.85%~100%;系统进化树结果显示,分离菌与松鼠葡萄球菌处于同一分支。动物试验结果表明,分离菌株对试验小鼠有较强的致病性,以0.2 mL/只（7.9×10⁸ CFU/mL）菌液的剂量接种小鼠,在48 h内死亡率为60%（3/5）。药敏特性分析结果显示,分离菌株对复方新诺明、氨苄西林等7种药物敏感,对克林霉素、头孢噻肟和头孢呋辛中度敏感,对青霉素、红霉素和林可霉素耐药。本研究为奶牛源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及防控提供了参考依据。     

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D 蛋白免疫 BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明, S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示, 腹水的抗体效价达到了1∶1 000 000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV) 5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与 PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究 PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。     

Isolation and Identification of Cellulase-producing Bacillus in Yak Rumen

To investigate the species of cellulase-producing Bacillus in yak rumen,10 samples of rumen content were aseptically collected from 10 adult Maiwa yaks to isolate the heat-resistant Bacillus by water bath at 80 ℃ for 20 min.The cellulase-producing strains were screened using the CMC-Na medium and Congo red staining.The 16S rRNA gene sequence of those cellulose-producing strains were amplified and sequenced.The results showed that 64 strains were isolated from the 10 samples.Total 23 strains were identified as cellulase-producing bacillus,including 16 strains of Bacillus cereus,7 strains of Bacillus thuringiensis.Furthermore,phylogenetic analysis showed that the 16 Bacillus cereus strains were clustered into two branches:One isolate was clustered into a branch alone,the other 15 isolates were clustered into a branch which clustered into 5 small branches,showing that there was certain genetic diversity in the isolates of Bacillus cereus.And all 7 Bacillus thuringiensis strains were clustered into a branch.Hence,the results layed the foundation of investigating the species of cellulase-producing Bacillus in yak rumen and developing probiotics special for yak.     

达乌尔黄鼠线粒体Cyt b基因序列特征及其系统进化分析

在甘肃省天祝藏族自治县采集12只达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus),PCR产物直接测序获得Cyt b基因1140bp序列,采用Clustal X 1.84、MEGA 6.0、Dna SP 5.0等生物信息学软件进行了序列特征和系统地位分析。结果显示,达乌尔黄鼠Cyt b基因含116个多态信息位点,群体中多态位点类型有转换、颠换,Cyt b基因T,C,A,G碱基含量分别为33.7%,25.9%,27.6%,12.9%。基于Kimura双参数的遗传距离显示,属内种间大黄鼠(Spermophilus major)与新疆黄鼠(Spermophilus fulvus)间遗传距离最小(0.034),高加索黄鼠(Spermophilus musicus)与达乌尔黄鼠最大(0.172),达乌尔黄鼠群体内遗传距离为0.140,种群分化较大,基于NJ法构建的系统进化树符合传统分类标准,研究为达乌尔黄鼠Cyt b基因标记的种群遗传学应用提供了参考。