HIV VRC01单链抗体的构建、原核表达及纯化

【目的】合成、克隆HIV单克降抗体VRC01的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。【方法】根据GenBank上公布的VRC01抗体可变区的氨基酸序列合成引物,运用基因从头合成和重叠延伸PCR方法,克隆抗体VRC01的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因;用15肽Linker(Gly4Ser)3将VH和VL基因相连,得到单链抗体基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,并分别将两者克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;将重组蛋白进行变性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行初步纯化。【结果】得到了VRC01的2种单链抗体的基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,其大小分别为770和768bp。SDS-PAGE电泳结果显示,scFv-VH-Linker-VL在大肠杆菌中不表达或表达量极低;而scFv-VL-Linker-VH表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,且主要以包涵体形式存在。Western blot检测结果证实,scFv-VL-Linker-VH可与His-Tag融合表达,并通过亲和层析法成功纯化获得了该单链抗体。【结论】成功构建、表达并纯化出了VRC01单链抗体,为进一步研究VRC01单链抗体的生物学特性奠定了基础。     

小苍兰3种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus (FreMV)、黄瓜花叶病毒Cucumubermosaic virus (CMV)和菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus (BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测小苍兰3种病毒的多重PCR检测体系.该体系能够一次扩增出FreMV,CMV和BYMV的特异片段,其大小分别是340、628和212 bp.测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达97％以上.灵敏度测定结果表明,从≥10-2mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒.     

抑制素基因免疫对母羊生殖内分泌的影响

用抑制素基因重组质粒（pCIS）免疫生产母羊,剂量分别为每只0．2mg、0．4mg和0．8mg,以生理盐水为对照。结果表明：免疫组抗抑制素抗体阳性率达46．7％。加强免疫后第45天,免疫组的促卵泡素（FSH）水平显著高于对照组（P〈0．05）。首次免疫后第20天与加强免疫后第45天抗体阳性羊的促卵泡素水平显著高于抗体阴性羊（P〈0．05）。与对照组相比,免疫组的雌激素（E2）与孕激素（P）水平无显著变化（P〉0．05）。抑制素基因免疫能调节绵羊的促卵泡素水平,但对雌激素与孕激素的水平无显著影响。     

利用荧光PCR快速检测松材线虫

利用荧光PCR从美国进境的木质包装材料中成功检出松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus).结果表明,探针检测松材线虫样品时,可产生明显的荧光信号,但空白水对照、小杆线虫(Rhabditida)、拟松材线虫(B.mucronatus)无荧光信号,表明探针有较强的特异性,且具有简单、灵敏、快速等特点.     

高价铁肠杆菌素受体蛋白FepA表面抗原决定簇基因的克隆及序列同源性分析

用PCR技术获取高价铁肠杆菌素受体蛋白FepA表面抗原决定簇基因,分析其在大肠杆菌种内的序列同源性。以提取的大肠杆菌基因组DNA为模板,设计一对基因特异引物,用PCR扩增的方法获得目的基因。将PCR扩增后得到的片段纯化并克隆至pMD19-T Simple Vector载体,用菌落PCR及酶切鉴定阳性菌落,对阳性菌落进行测序,并与Gene Bank公布的大肠杆菌区段进行序列同源性分析。扩增出598bp的含有受体蛋白FepA表面抗原决定簇基因的目的片段,经测序分析其种内的序列同源性为95%～99%,为今后制备针对该区段的抗体奠定了基础。     

非编码RNA检测技术的研究进展

非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）广泛存在于生物体中,不编码蛋白质,以RNA的形式在许多生命过程中发挥着重要的作用。随着越来越多ncRNA生物学功能的揭示,检测ncRNA在不同生理和病理状态下表达谱的变化,已迅速成为研究的热点。为了将ncRNA更好地应用于农业生产和生物医学研究,笔者对ncRNA最新检测技术的原理与应用进行了综述。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。     

不同荞麦品种落粒基因的筛选

为获得荞麦落粒性相关基因,分别选取甜荞、苦荞和金荞的不同品种不同组织混合样品进行转录组测序,通过数据库比对、功能分析与功能注释获取与落粒性相关的Unigene。设计引物通过RACE方法扩增候选基因,测序后将候选基因全长序列提交到NCBI数据库中,通过blast寻找候选基因的命名,用实时定量荧光PCR测候选基因的表达量。结果表明:得到6个候选基因,其中,根向光性蛋白基因、SOBIR1-like蛋白基因、NPR5-like蛋白基因主要在花器官的发育和形成过程中起调控作用,而SRG1-like蛋白基因、过氧化物酶基因和AGL蛋白基因主要在植物离区的形成和发育过程中起调控作用。NPR5-like蛋白基因在落粒品种与不落粒品种间的表达量差异最大。结论:NPR5-like蛋白基因在荞麦落粒过程中起一定的调控作用。     

小鼠RPL9基因克隆及组织表达差异性研究

根据已报道的小鼠核糖体蛋白L9基因( RPL9)序列设计PCR引物,克隆RPL9基因,并以β-actin为内参基因,采用相对荧光定量RT-PCR方法,检测、分析RPL9基因mRNA在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑及脂肪7个组织中表达量的差异。结果表明,成功克隆出RPL9基因序列全长,该基因在小鼠的7个组织中均有不同程度的转录表达,其中,在脂肪中的表达量最高,在肾、脾和脑中的表达量较高,在心、肝中的表达量较低,在肺中表达量最低。     

蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系的建立与应用

【目的】 针对生产中危害严重的3种蔬菜土传病原菌瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、尖镰孢（Fusarium oxysporum）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）,建立三重PCR（triplex PCR）检测体系,为蔬菜土传真菌病害的早期诊断和鉴定提供技术与方法。【方法】 筛选3种病原菌特异性引物组合,通过设定不同的PCR退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响三重PCR扩增的因素,建立蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系,并对体系灵敏度进行检测。为了验证建立体系的稳定性,选择2×Taq Master PCR Mix（北京博迈德生物技术有限公司）和TaKaRa Taq酶（大连宝生物工程有限公司）2个不同公司的试剂,分别利用C1000 Touch ^TM型（赛默飞世尔科技有限公司）与Aeris ^TM型（新加坡艺思高科技有限公司）热循环仪进行三重PCR反应,比较检测结果的可重复性。对田间采集的35份病害样本和149份土壤样本,分别进行三重PCR和病原菌分离检测,以确定所建立得三重PCR检测体系的适用性。 【结果】 三重PCR反应体系中引物对AsAPH2B/AsPyF、FOF1/FOR1、VActF/VActR可分别扩增出瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌长度为163、328和530 bp的特异性目的片段。反应体系（25 μL）：0.12 μmol·L ^-1 AsAPH2B/AsPyF,0.16 μmol·L ^-1 FOF1/FOR1,0.24 μmol·L ^-1 VActF/VActR,2×Taq Master PCR Mix 12.5 μL,退火温度为60.8℃,35个循环。该体系对病原菌纯培养物的检测灵敏度为10 ^-1ng·μL ^-1,对土壤中大丽轮枝菌、尖镰孢和瓜果腐霉的检测灵敏度分别为10 ⁵、10 ⁶个孢子/g土壤和10 ^-2mg菌丝/g土壤。分别采用2×Taq Master PCR Mix和TaKaRa Taq酶,利用C1000 Touch ^TM型和Aeris ^TM型热循环仪进行三重PCR,扩增结果一致,说明三重PCR体系检测稳定性好。对田间采集的病害和土壤样本进行检测,25份病害样本和71份土壤样本中检测出带菌,三重PCR检测与病原菌分离培养结果一致。 【结论】 本研究建立的瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌三重PCR检测体系具有灵敏度高、稳定性和重复性好的特点,能够快速、准确地检测田间病株及其根围土壤中的瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌,为蔬菜土传病害的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。