A survey of FIV antibodies and FeLV antigens in free-roaming cats in the capital area of Finland.

Feline immunodeficiency virus (FIV) was first isolated and identified in 1986. Since then it has been shown to have a worldwide distribution, and the infection generally appears to have reached a state of endemicity. This is the 1st study of FIV-prevalence in Finland. Serum samples of 196 free-roaming cats were tested for antibodies to FIV and FeLV antigens (Feline leukemia virus). With a combined enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), 13 of the cats (6.6%) turned out to be positive for FIV and 2 for FeLV (1.0%). Adult male cats in the capital area of Finland had a FIV prevalence of 24%, a relative proportion 4.7 times higher than that for females.     

siRNA干扰ATGL基因表达对猪脂肪细胞脂肪分解的抑制作用

【目的】探讨猪脂肪甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)基因在脂肪细胞脂解中的作用。【方法】构建针对猪ATGL基因CDS区113和1 358位点的慢病毒干扰载体,包装后用其感染猪成熟脂肪细胞,检测ATGL和激素敏感脂酶(hormone-sensitive lipase,HSL)基因mRNA及其蛋白的表达情况;用甘油试剂盒检测细胞甘油释放量。【结果】成功构建了ATGL基因的慢病毒干扰载体,用其感染猪成熟脂肪细胞后,RT-PCR分析和Western印迹检测结果表明,试验组脂肪细胞ATGL的表达显著下调,HSL的表达没有明显变化;甘油释放量显著降低,其中针对ATGL基因CDS区113位点的siRNA1对ATGL mRNA的干扰效率达55%,甘油释放量降低了49%。【结论】成功构建了猪ATGL基因慢病毒干扰载体,其能显著降低ATGL基因mRNA及其蛋白在猪成熟脂肪细胞中的表达,降低脂肪细胞的甘油释放量,表明ATGL在猪脂肪细胞脂解中有着重要作用,且113位点是ATGL基因CDS区的最佳干扰靶位点。     

Myostatin基因沉默绵羊成纤维细胞系的建立

旨在获得肌肉生长抑制素( Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础.针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染成纤维细胞,采用RT-PCR进行筛选;构建慢病毒干扰载体,包装病毒,感染成纤维细胞,采用流式细胞技术分选阳性细胞,阳性细胞予以测序鉴定并检测沉默效果.结果,获得Myostatin基因沉默效率约90％的RNA干扰片段PSL1,包装病毒获得滴度为1×108的病毒颗粒,流式细胞技术分选得到纯度达99％的Myostatin基因沉默成纤维细胞系.采用慢病毒感染接合流式细胞术分选,能较快获得无抗性标记的转基因阳性细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊及探索Myostatin的调控机理奠定基础.     

水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析

试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体（bbu-miR-302s）,对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞（BFF）后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞（iPSC）。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×10⁶TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。     

精子与慢病毒共孵育条件的优化以及转基因猪的制备

【目的】探索慢病毒与精子共孵育的方法,并制备转基因猪。【方法】采用正交试验分析精子密度、病毒量、精子与慢病毒共孵育时间、精子与慢病毒共孵育温度对精子活力的影响,采用PCR和Southern blotting检测转基因。【结果】①优化慢病毒与精子共孵育条件为：100 µL慢病毒原液（5×105cfu）与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min;②与病毒孵育后的精子（109个/mL）给母猪人工授精时,经PCR检测49头仔猪中有14头呈阳性;③Southern blotting结果表明,8头PCR阳性仔猪中,4头融合了外源基因。【结论】优化了精子与慢病毒共孵育的条件（100 µL慢病毒原液（5×105cfu）与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min）,成功制备了转基因猪,并检测有外源基因的融合。     

慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞

提取第28期伊萨鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),将其与性腺基质细胞共培养,并对PGCs进行PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定。构建pL-CMV-eGFP慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs,转染率高达24.19%。     

转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立 及抗猪瘟病毒转基因猪的构建

【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞,将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中,获得体细胞核移植胚胎,移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建,对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株,其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用,将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植,获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响,筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果;通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段（P2）的转基因猪。     

QUANTITATIVE TC-99m-MDP JOINT SCINTIGRAPHY IN A LENTIVIRUS-INDUCED ARTHRITIS OF GOATS

Caprine arthritis-encephalitis (CAE) is a lentivirus-induced disease of goats used as a model for the study of lentiviral infections. Tc-99m-MDP scintigraphy was investigated as a method to quantitate the severity of joint inflammation in CAE virus-induced arthritis in six goats (12 carpi). Carpal/metacarpal Tc-99m-MDP uptake ratio was compared to a clinical indicator of joint inflammation and histopathologic grading. Quantitative joint scintigraphy provided a better correlation (r = 0.75, p < 0.001) with histopathologic grading than the clinical indicator (r = 0.18, p > 0.10). Quantitative Tc-99m-MDP joint scintigraphy should be used when non-invasive quantitation of joint inflammation is needed for pathogenetic studies of CAE.