西藏牦牛12SrRNA基因全序列测定及系统进化关系

以西藏11个地区的牦牛类群共计110头为研究对象,采用PCR方法,首次从耳组织总DNA中扩增出了线粒体12SrRNA基因,并进行了序列测定及分析。结果表明,该基因的长962～965bp;序列分析表明12SrRNA基因有较高的进化速率,11个地区的牦牛品种同源性相对较高;对11种类群的牦牛及亚洲水牛、非洲水牛、欧洲野牛和家牛四种牛亚科的12SrRNA基因序列建立NJ和ME分子进化树,结果显示帕里牦牛、斯布牦牛、巴青牦牛、丁青牦牛、江达牦牛、工布江达牦牛、康布牦牛与桑日牦牛的亲缘关系最近。     

牦牛基因组和转录组研究进展

为了解牦牛基因组和转录组研究现状,以"牦牛、基因组、转录组和高通量测序"为关键词,对2012—2018年的研究进展进行文献检索。研究发现:在牦牛基因组研究方面,已有研究对牦牛基因组进行了首次测序和重测序分析,构建了基因组"草图"和变异图谱,比较了家、野牦牛及与其他物种间全基因组水平上的异同,阐释了牦牛高原适应的遗传学机制,探究了牦牛的驯化和群体历史发展动态,初步揭示了牦牛与普通牛种间杂交渐渗状况,并对部分性状(如角、多肋性状)进行了全基因组关联分析和遗传机理揭示;在牦牛转录组研究方面,已有研究对牦牛睾丸、卵巢、心脏等多个组织器官及不同发育阶段的卵母细胞和胚胎细胞进行了转录组分析,发掘出一批潜在的与牦牛经济性状及一些生物学变化相关的差异表达基因。为推动牦牛分子育种进程,应进一步利用高通量测序技术获得牦牛大数据,继续完善牦牛全基因组结构。     

西藏阿里地区改则县两个牦牛遗传资源群体评估

本研究利用18对微卫星对西藏阿里地区改则县的16头本地牦牛和18头半野血牦牛进行遗传多样性评估。结果显示,18对微卫星的平均等位基因数为7.44,其中TGLA73, BM2113和BGR3012,三个位点的观测杂合度最高为1.0000,AGLA293位点的观测杂合度最小为0.2049。改则县本地牦牛的期望杂合度(HE±SD=0.7000±0.0422)、观测杂合度(HO±SD =0.7243±0.0270)、平均等位基因数(NA=6.22±2.86)以及多态信息含量(PIC=0.636)均要高于改则县半野血牦牛(HE±SD=0.6864±0.0394,HO±SD=0.6940±0.0265,NA=6.06±2.44,PIC=0.622)。另外两个群体之间的遗传分化指数FST=-0.00542,同时结合主成分分析,发现两个群体遗传分化不明显。     

四川石渠县牦牛源蜱感染巴尔通体的分子流行病学调查

为了解四川省石渠县牦牛体表寄生蜱的种类及其巴尔通体的感染情况。采集牦牛体表的蜱,经形态学初步鉴定后,提取蜱总DNA,PCR扩增蜱细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因和巴尔通体gltA基因,对阳性产物测序、比对,并构建系统进化树,从而确定蜱及其携带巴尔通体的种类。结果表明:在石渠县4个乡共采集到蜱818只,其中西藏革蜱占78.97%(646/818)、青海血蜱占21.03%(172/818);蜱巴尔通体的总感染率为30.07%,其中阿日扎乡、麻甲乡、德荣玛乡、长须干玛乡蜱巴尔通体的感染率分别为4.76%、76.79%、12.50%、17.95%,麻甲乡西藏革蜱巴尔通体感染率显著高于其他地点(P<0.01),麻甲乡青海血蜱巴尔通体感染率(79.07%)高于西藏革蜱(69.23%),但无显著差异(P>0.05)。经比对分析,总共得到3条序列(uncultured Bartonella sp. shiqu 1,uncultured Bartonella sp. shiqu 2和uncultured Bartonella sp. shiqu 3)。遗传进化分析显示,uncultured Bartonella sp. shiqu 1和uncultured Bartonella sp. shiqu 2与未定种的Bartonella spp. RF124HAIN (FJ464240)亲缘关系最近;uncultured Bartonella sp. Shiqu 3与对人有致病性的Bartonella melophagi亲缘关系最近。综上,石渠县存在西藏革蜱和青海血蜱,蜱巴尔通体感染率较高,并且具有感染人的风险。     

牦牛瘤胃微生物抗生素抗性基因对3种外源性刺激因子的响应

通过给牦牛投喂硫酸头孢喹肟(CEF)、盐酸二氟沙星(DIF)和黄曲霉毒素B1(AFB1),并进行瘤胃微生物宏基因组测序,旨在揭示这3种外源性刺激因子对抗生素抗性基因(ARGs)种类、抗性类型、抗性机制等的影响,对于深入研究微生物抗性组特征和抗性机制具有重要价值。选取15头牦牛,随机分5组。Cef组和Dif组分别根据说明书推荐剂量按体重计算、灌服CEF 1 mg·kg^-1和DIF 1 mL·kg^-1;E1组和E2组分别按采食量投喂AFB120、60μg·kg^-1;C组为对照组。处理7 d后,采集瘤胃液,提取DNA,Illumina HiSeq测序,对reads counts进行标准化得到TPM值,并进行方差分析。结果显示,对照组共获得132种ARGs,分属30种抗性类型,其中,四环素类tetQ和tetW基因丰度较高;Cef组tetW基因丰度增加(P<0.05),Dif组tetQ丰度增加(P<0.05);Cef组四环素类和头孢菌素类抗性基因丰度增加(P<0.05),Dif组四环素类和氨基香豆素类抗性基因丰度增加(P<0.05),E1组氨基香豆素和青霉烯类抗性基因丰度增加(P<0.05),E2组青霉烯类、头孢菌素类等9类抗性基因丰度均增多(P<0.05);Dif组Erm基因23S核糖体RNA甲基转移酶丰度增加(P<0.05),E2组中ATP结合盒超家族等3种抗性机制相关基因的丰度增加(P<0.05);3种因子均显著增加四环素类ARGs宿主的种类。结论:瘤胃是蕴含丰富ARGs的储藏库,其中,四环素类抗生素抗性基因tetQ和tetW是主要的ARGs。不仅CEF和DIF使部分ARGs的种类、抗性类型以及耐药机制相关酶等的丰度升高,增加瘤胃微生物的耐药性,而且AFB1也具有类似作用,且高剂量AFB1对抗性类型的影响范围较抗生素大。这3种因子还导致携带四环素类ARGs宿主微生物的种类数量增加,从而强化横向转移机制,加快ARGs传播,增强微生物对四环素类的耐药性。     

牦牛CRH基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

为了探讨促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）基因在牦牛繁殖中的调控作用，试验分别采集5头成年母牦牛和5头成年母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫等组织，通过RT-PCR技术及生物信息学软件对牦牛CRH基因编码区进行扩增、克隆及序列分析，并构建系统进化树；采用实时荧光定量PCR法检测CRH基因的组织表达。结果表明，牦牛CRH基因编码区全长573 bp，编码190个氨基酸。牦牛与黄牛、猫、鸡、人、小鼠、大鼠和猪的CRH基因核苷酸同源性分别为99.8%、43.3%、36.1%、46.2%、39.0%、38.5%和56.4%。系统进化树表明，牦牛与黄牛亲缘关系最近，并与其他物种类聚，符合物种进化规律。CRH蛋白分子式为C₉₂₀H₁₅₀₃N₂₇₉O₂₆₃S₃，分子质量为20776.95 u，理论等电点为10.95，其氨基酸组成中亮氨酸（L）、脯氨酸（P）、丙氨酸（A）和精氨酸（R）所占比例较高，分别为15.8%、12.6%、12.1%和10.5%。CRH蛋白为不稳定亲水蛋白，存在信号肽和跨膜结构。CRH蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占41.05%、1.05%、8.42%和49.48%，三级结构分析结果与其相一致。CRH基因mRNA在牦牛下丘脑中表达量最高，显著高于其他组织（P<0.05），在子宫中表达量最低。牦牛脑垂体前叶CRH基因mRNA表达量极显著高于黄牛（P<0.01），在卵巢、输卵管中表达量显著高于黄牛（P<0.05），而两个品种在下丘脑、子宫中的表达量差异不显著（P>0.05）。提示CRH基因在牦牛繁殖调控中具有重要作用。     

Dynamics of apoptosis-related gene expression during follicular development in yak

The potential reproduction power of domestic animals is limited by a complicated follicular atresia process. P53, caspase-9 (Casp9), Bax, Bcl-2 and Fas play a crucial role in the ovarian mitochondrion-dependent apoptosis and death receptor pathway. In accordance with this study, the expression levels of Casp9, Bax, Bcl-2 and Fas were analysed in ovaries and oviducts of yak by immunohistochemistry (IHC). P53 and the above in ovarian granulosa cells (GCs) from atretic (3–6 mm) to healthy follicles (6–8 mm) and in oviducts were examined from the luteal phase to the follicular phase during the oestrous circle by Western blot (WB) and real-time PCR (RT-PCR). Results demonstrated that typical classic apoptotic factors Casp9, Bax, Bcl-2 and Fas were expressed in the cytoplasm and zonal pellucida of oocytes, primordial follicles, primary follicles, ovarian surface epithelium, ovarian GCs, granular lutein cells, surface epithelia in oviduct uterotubal junction and oviduct ampulla during the luteal phase. RT-PCR and WB revealed that P53 and Fas significantly increased in GCs of atretic follicles. P53 and Casp9 increased in oviduct epithelium during the luteal phase, but Fas was unchanged. A contrary tendency was noted in Bcl-2 and Bax expression. Overall, P53 and Fas play an essential role in inducing GC apoptosis, and Bax, Bcl-2, Casp9 and P53 are involved in oviduct epithelial regeneration in yak.     

三个牦牛品种生长激素受体(GHR)基因PCR-SSCP分析

为了加速牦牛群体的复壮,本实验利用PCR-SSCP技术对甘南、天祝、青海高原3个牦牛品种的生长激素受体基因进行了多态性分析。结果表明:第1、3对引物扩增无多态,第2对引物扩增3个牦牛品种均发现2个等位基因A和B,天祝白牦牛A的基因频率为0.3682,B的基因频率为0.6318;甘南牦牛A的基因频率为0.1596,B的基因频率为0.8404;高原牦牛A的基因频率为0.0700,B的基因频率为0.9300。青海高原牦牛群体处于哈代-温伯格平衡状态,而甘南和天祝牦牛处于不平衡状态,应加强对该基因位点的选择强度。     

中甸牦牛犊牛培育的关键技术措施

中甸牦牛是云南省迪庆藏族自治州高海拔地区农牧民的主要当家畜种,但是,在传统的养殖方式下,中甸牦牛犊牛培育中还存在着犊牛无保暖设施、吃奶不足、补饲程度低、体质较差、疫病防治不到位等问题,因此,针对中甸牦牛犊牛管理中存在的问题,提出了加强保暖设施建设、妊娠母牦牛管理以及初生犊牛的抚育、补饲、疫病防治等一系列关键技术措施。     

牦牛PRLHR基因的克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在对牦牛催乳素释放激素受体（prolactin releasing hormone receptor,PRLHR）基因进行克隆、序列分析及组织表达研究。采集5头母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,采用RT-PCR技术扩增得到PRLHR基因cDNA全长,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的生物信息学特征,利用实时荧光定量PCR技术测定PRLHR基因在牦牛及黄牛各组织中的表达量。结果显示,牦牛PRLHR基因序列长1 625 bp,其中CDS区1 113 bp、5'-UTR 22 bp和3'-UTR 490 bp,编码370个氨基酸,与黄牛、水牛、绵羊、猪和人的核苷酸序列有较高的同源性,在进化过程中十分保守;牦牛PRLHR为不稳定疏水蛋白,无信号肽,存在7个跨膜结构域;有13个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;有3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点;蛋白二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别为49.19%、31.89%、15.68%和3.24%;蛋白质三级结构预测显示,牦牛PRLHR蛋白具有GPCRs超级家族中PrRP家族的典型结构域。实时荧光定量PCR结果表明,PRLHR基因在牦牛输卵管组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）;在牦牛下丘脑、脑垂体前叶、子宫和输卵管组织中的表达量极显著高于黄牛（P<0.01）。试验成功克隆得到牦牛PRLHR基因序列,并对其进行了生物信息学和组织表达特性分析,为进一步研究PRLHR基因在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定了基础。