荧光定量PCR技术优化及在草莓上的应用

[目的]为优化荧光定量PCR技术体系并在草莓研究中应用.[方法]以二倍体草莓(Fragaria vesca‘Ruegen’)为试材,草莓当中两个β-肌动蛋白基因家族成员Actin1和Actin2为内参基因,对比分析10 μL和20 μL反应体系条件下荧光定量PCR扩增反应.[结果]内参基因引物组合Actin1的扩增效率等指标优于Actin2;10μL反应体系中的扩增效率等指标优于20 μL反应体系;内参基因Actin1在10 μL反应体系下是草莓最优的荧光定量PCR技术体系.[结论]优化了草莓荧光定量PCR体系并应用该技术体系检测了草莓CrRLK1Ls家族成员的时空表达情况.     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。【方法】根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3 (5′-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3′)、A.apis-B3 (5′-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3′)、A.apis-FIP (5′-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3′)和 A.apis-BIP (5′-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3′),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg²⁺终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^-1, dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1, 内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol?L^-1,甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L^-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）、蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus,DWV）、蜜蜂囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV）、黑蜂王台病毒（Black queen cell virus,BQCV）和以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus,IAPV）基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、02231×10^-5、0.2231×10^-6、0.2231×10^-7、0.2231×10^-8 μg·μL^-1作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^-1 Mg²⁺、1.2 mmol·L^-1 dNTPs、1.6 mmol·L^-1 FIP/BIP、0.4 mol·L^-1甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、0.2231×10^-5 μg·μL^-1作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^-6 μg·μL^-1。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。     

玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法

为了提高口岸和基层实验室检疫和监测玉米细菌性枯萎病菌的准确性和工作效率,利用环介导恒温扩增技术(LAMP),根据内切葡聚糖酶(EGase)基因前导序列,设计2个内引物和2个外引物,对玉米细菌性枯萎病菌进行快速检测。结果表明,使用玉米细菌性枯萎病菌的近缘种或引致相似症状的病原菌菊欧文氏菌玉米致病变种Erwinia chrysanthemi pv.zeae、玉米内州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、燕麦假单胞菌Pseudomonas avenae、杓兰欧文氏菌Erwinia cypripedii检测其特异性,仅玉米细菌性枯萎病菌有扩增。LAMP检测灵敏度达到2 pg DNA,为普通PCR的100倍;与其它检测方法相比,LAMP方法检测时间短,效率高,不仅降低了设备投入,易于操作,而且具有较高的灵敏度和特异性,适合玉米细菌性枯萎病菌的现场检疫和大规模检测。     

矮生观赏杉木DNA甲基化的水平与模式分析

为探讨杉木矮化变异与DNA甲基化的关系,以矮生观赏杉木与野生杉木为试验材料,采用基于DNA甲基化敏感扩增多态性分析（Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP）方法,研究其DNA 序列CCGG 位点的甲基化水平及模式变化特征。应用20个引物组合,在矮生观赏杉木和野生杉木的叶片DNA中均检测出745个CCGG位点,其中甲基化位点数分别为508个和505个,分别占总扩增位点数的68.17%和67.83%;在矮生观赏杉木与野生杉木木质部DNA中分别检测到742个和737个CCGG位点,其中甲基化位点数分别为471个与498个,分别占总扩增位点数的63.52%和67.51%,差异达极显著水平（P < 0.01）。与野生型相比,矮生观赏杉木叶片和木质部DNA甲基化模式发生了一定变化,在叶片DNA中,去甲基化率为17.81%,明显高于超甲基化率15.44%;在木质部DNA中,去甲基化率17.25%,也明显高于超甲基化率14.65%。通过甲基化序列的初步克隆及比对分析发现,矮生观赏杉木中参与MAPK级联途径的蛋白磷酸酶IBR5基因启动子区域的甲基化水平上升。因此推测,植物激素信号转导及其调控基因的甲基化变化可能是矮生观赏杉木形成的原因之一。     

LAMP assay and rapid sample preparation method for on‐site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine

In Europe the most devastating phytoplasma associated with grapevine yellows (GY) diseases is a quarantine pest, flavescence dorée (FDp), from the 16SrV taxonomic group. The on‐site detection of FDp with an affordable device would contribute to faster and more efficient decisions on the control measures for FDp. Therefore, a real‐time isothermal LAMP assay for detection of FDp was validated according to the EPPO standards and MIQE guidelines. The LAMP assay was shown to be specific and extremely sensitive, because it detected FDp in all leaf samples that were determined to be FDp infected using quantitative real‐time PCR. The whole procedure of sample preparation and testing was designed and optimized for on‐site detection and can be completed in one hour. The homogenization procedure of the grapevine samples (leaf vein, flower or berry) was optimized to allow direct testing of crude homogenates with the LAMP assay, without the need for DNA extraction, and was shown to be extremely sensitive.     

核酸标准物质研究现状

以核酸扩增为基础的分子诊断技术越来越广泛的应用于医学研究、出入境检验检疫、疫病诊断等领域,核酸标准物质是保证体外诊断检测数据和结果准确一致的重要材料。作者介绍了国内外核酸标准物质的发展历史、研究现状及面临的挑战,展望了核酸标准物质未来发展方向。     

马疱疹病毒1型LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种检测马疱疹病毒1型（EHV-1）的快速、灵敏、特异的环介导等温扩增技术（LAMP）,同时评价该方法的可靠性。根据马鼻肺炎糖蛋白B（gB）基因特异保守序列设计多对LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程,进行引物筛选和反应条件的优化,建立能特异性扩增EHV-1 DNA的LAMP检测方法,并加入SYBR GreenⅠ通过肉眼判断结果。该方法在65 ℃恒温下作用50 min,使EHV-1 DNA获得了高效率的特异性扩增,与其他马易感病毒如马疱疹病毒4型（EHV-4）等无交叉反应;且具有极高的灵敏性,可检测到10^-4稀释的目标病毒,比普通PCR的灵敏度高10倍;反应结束后加入SYBR GreenⅠ肉眼观察的结果与LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过将4份临床样品的LAMP检测结果与已得到验证的PCR结果进行比对,结果显示符合率为100%。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、简单易操作且设备要求低等特点,具有实地检测EHV-1的前景。     

一个新的土壤重金属竞争吸附等温模型

A new competitive adsorption isothermal model (CAIM) was developed for the coexistent and competitive binding of heavy metals to the soil surface. This model extended the earlier adsorption isothermal models by considering more than one kind of ion adsorption on the soil surface. It was compared with the Langmuir model using different conditions, and it was found that CAIM, which was suitable for competitive ion adsorption at the soil solid-liquid surface, had more advantages than the Langmuir model. The new competitive adsorption isothermal model was used to fit the data of heavy metal (Zn and Cd) competitive adsorption by a yellow soil at two temperatures. The results showed that CAIM was appropriate for the competitive adsorption of heavy metals on the soil surface at different temperatures. The fitted parameters of CAIM had explicit physical meaning. The model allowed for the calculation of the standard molar Gibbs free energy change, the standard molar enthalpy change, and the standard molar entropy change of the competitive adsorption of the heavy metals, Zn and Cd, by the yellow soil at two temperatures using the thermodynamic equilibrium constants.     

新型的高性能小信号放大器

针对设计高质量小信号放大器存在的许多问题,文章提出了一种新型的高性能小信号放大器,电路采用ICL公司生产的运算放大器,设计了一种新电路,结构简单,成本低廉,性能优异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因RT-LAMP检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)M基因保守序列6个特异性部位设计了 2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法。结果表明,该方法灵敏度比RT-PCR高100倍;全部反应可在1 h内完成并可得到其特有的阶梯状条带,而且猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光而直接判定结果。该方法灵敏度高、特异性好,可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法。