番茄溃疡病菌LAMP快速检测方法的建立

以SYBR Green I为指示剂,建立了番茄溃疡病菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据番茄溃疡病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物进行LAMP扩增,通过对体系中各成分进行优化,最终确定25μL反应体系中模板200ng,MgSO4的适宜浓度为3.0mmol/L,Bst DNA聚合酶2U,dNTPs的适宜浓度为0.3mmol/L,外引物与内引物之比为1∶3时扩增效果较好,在65℃最佳反应时间为40min。在优化的体系条件下,获得的反应产物经SYBR Green I染色后,肉眼观察检测灵敏度可达到50CFU/mL,且对番茄溃疡病菌的检测具有高度的特异性。结果表明,该方法快速、准确、灵敏、特异,具有良好的实用性。     

基于PCR的两步法丝状真菌基因敲除方法

基因敲除是研究真菌基因功能的重要方法之一,目前,丝状真菌敲除多采用基因两侧的同源臂对基因组的靶标进行同源替换,然后采用抗生素对转化子进行筛选,但这存在着筛选效率低、假阳性率高、操作复杂等问题。本研究以稻瘟菌为研究对象,采取以下步骤对此进行优化:1)构建HPH-GFP(潮霉素-绿色荧光蛋白)融合表达载体; 2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因上、下游片段; 3)克隆上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段; 4)嵌合体片段转化真菌原生质体; 5)对敲除突变体进行筛选。结果表明,该法操作简便、高效,除了用潮霉素HPH作为筛选标记外,还可用GFP作为荧光筛选标记,极大提高了筛选效率,可用作丝状真菌基因功能研究。     

基于qPCR和LAMP技术的马铃薯晚疫病菌快速检测方法

马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）能侵染多种茄科植物,它引起的马铃薯晚疫病,是马铃薯生产中的第一大病害。为了开发能在田间快速检测马铃薯晚疫病病原的方法,利用P. infestans T30-4基因组测序数据的contig 1.18131,设计qPCR和LAMP引物,优化扩增条件后得到引物的特异性和灵敏度,最后通过检测田间收获薯块,比较形态学传统方法、qPCR及LAMP的差异。特异性检测结果发现,qPCR和LAMP仅在含有P. infestans DNA模板的体系有阳性扩增,在寄主和其他微生物DNA中均无扩增;在优化的条件下,qPCR和LAMP的检测下限可达1×10 ^-6ng/μL,在有寄主和其他微生物DNA存在的条件下,引物的灵敏度没有显著差异。利用两种快速方法对在大理、丽江及昆明3个地区田间收获薯块上检测发现,qPCR和LAMP方法得到的检出率差异极为不显著（P=0.420）,两种快速检测方法和形态学鉴定方法检出率差异极显著（P=0.009）。在大理、丽江及昆明3个地区的薯块中,两种分子检测方法检出率均比形态学方法高。其中,qPCR检测方法比形态学方法分别提高了12.00%、2.00%、8.70%;LAMP检测方法比形态学方法分别提高了11.30%、2.00%、8.70%。     

奥尔森帕金虫环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

奥尔森帕金虫是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、灵敏、准确和使用简便的检测方法,实验根据奥尔森帕金虫5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)序列,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应温度、反应体系中Mg2+浓度和反应时间进行了优化。该方法的检测灵敏度约为30拷贝质粒DNA,并且特异性较强,与海水帕金虫、包纳米虫、波豆虫及急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)等病原均无交叉反应。使用LAMP法对两批菲律宾蛤仔样品进行检测,结果表明,LAMP检测与传统PCR检测相比,灵敏度更高,检测结果更准确。实验所建立的奥尔森帕金虫LAMP检测方法简单、快速、灵敏且特异性强,可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用。     

白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因保守序列,利用Primer Explorerv 4.0软件设计了4条引物,建立了白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化,同时将建立的LAMP检测方法与巢式PCR进行了比较分析。结果表明,LAMP最适反应在64℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果。LAMP方法的最低检出限为100拷贝/μL,灵敏度较巢式PCR高100倍,而且LAMP方法在1h内即可完成检测,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果。用建立的LAMP方法对临床发病南美白对虾样品进行了检测,结果表明,LAMP方法适合对虾白斑综合征病毒的现场快速检测。     

食蚊鱼CYP19a基因的克隆与序列分析

硬骨鱼类CYP19基因与生物的性别分化和激素调节相关,因此可开发用来探究环境激素污染与基因表达的关系。本研究首次克隆和分析了食蚊鱼CYP19a cDNA的全系列,为将CYP19基因作为监测环境激素生物标志物的研究提供了全面的实验数据。根据CYP19a基因c DNA保守区域设计引物,扩增保守区域并测序。采用RACE法扩增食蚊鱼CYP19a基因c DNA序列全长,对其蛋白序列进行同源性分析,并将序列应用于CYP19a mRNA转录水平的RT-PCR法检测中。成功克隆食蚊鱼CYP19a基因全长,获得CYP19a基因总长为2020 bp,ORF为238~1791 bp,共编码518个氨基酸,对其编码的蛋白质进行有关信号肽、跨膜螺旋、亲水性/疏水性、一级结构、二级结构和三级结构分析,与其他硬骨鱼类底鰆、青鰆、平鲷、鲫、鲤和斑马鱼的性腺CYP19a基因作同源性比较,其基因相似度分别为93%、84%、84%、71%、71%和66%。用MEGA6.0软件对19个物种的CYP19a基因进行聚类分析,食蚊鱼CYP19a基因与底鰆、青鰆同源性最高,说明芳香化酶在进化上相对保守。确定从食蚊鱼性腺所克隆的CYP19a基因是芳香化酶基因,证明食蚊鱼的芳香化酶是由CYP19a和CYP19b两种基因编码的。食蚊鱼卵巢芳香化酶具有3个高度保守的片段,并具有催化活性。     

鸡Mx基因全长cDNA序列的克隆及分析

以Poly(I)-Poly(C)诱导鸡成纤维细胞Mx基因的表达,提取总RNA,RT-PCR扩增出全长Mx cDNA,扩增产物克隆入pMD19-T Simple载体中进行序列测定。结果表明:与GenBank公布的鸡Mx cDNA序列相比,其同源性达99.9%,为进一步研究鸡Mx基因的抗病毒活性和作用机理奠定了基础。     

Molecular Cloning and Characterization of a Novel Gene Involved in Fatty Acid Synthesis in Brassica napus L.

Based on the sequence of a novel expressed sequence tag (EST), the full-length cDNA of 1 017 nucleotides was cloned from Brassica napus cv. Xiangyou 15 through rapid amplification of cDNA ends (RACE). The gene was designated as Bnhol34 (HQ585980), encoding a protein of 338 amino acids. BLAST analysis showed no high degree of sequence identity to any known gene. The calculated molecular weight of the Bnhol34 protein was 36.23 kDa, and the theoretical isoelectric point was 8.74. The Bnhol34 was also cloned from a high oleic acid mutant 854-1 through homologous cloning. There was no difference between the two Bnhol34 genes. Bnhol34 was localized in a tissue-specific manner in B. napus, and its expression level was about eight-fold greater in Xiangyou 15 seeds than in 854-1. The promoter region sequences of Bnhol34 were then isolated from Xiangyou 15 and 854-1, and a 93-bp deletion was found to occur in the Bnhol34 promoter region of 854-1. Three abscisic acid-responsive cis-elements (ABRE) were identified in the promoter region of Xiangyou 15. Real-time PCR analyses revealed that exogenous abscisic acid increased Bnhol34 expression by about four-fold in Xiangyou 15 seeds, yet did not change Bnhol34 expression in 854-1. It appeared that Bnhol34 might be abscisic acid insensitive in 854-1.     

高校图书馆“一站式”信息服务环境中导读系统的实现

通过高校图书馆“一站式”导读系统的特点、设计思想及界面设计,阐述了本导读系统的功能以及实现该功能的关键技术。作为信息传播途径之一,导读系统的设计,提高了高校图书馆的服务质量和宣传方式。     

Evaluation of the Abbott LCx Mycobacterium Tuberculosis Assay for Direct Detection of Mycobacterium Bovis in Bovine Tissue Samples

The commercial LCx amplification assay, usually employed to detect the Myocobacterium tuberculosis complex in respiratory specimens, was evaluated by comparing the results it gave with those obtained using Löwenstein-Jensen solid medium and pathological findings on 55 lymph nodes from cattle with positive and 10 lymph nodes from cattle with negative skin tests for tuberculosis. Fifty-three cultures (51 and 2, respectively) were positive for M. bovis, while the results for the LCx assay and the histological method were positive in 48 (45, 3) and 24 (20, 4) samples, respectively. None of the samples from cattle from certified tuberculosis-free herds were positive by any of the procedures. The results obtained with the LCx assay, compared with the culture procedure, regarded as the gold standard among the diagnostic techniques, gave a specificity of 91.6% and sensitivity of 90.5%. Although the sensitivity of LCx was suboptimal, DNA of M. bovis was detected in 81.8% of the skin test-positive animals. Amplification techniques could provide a rapid and reasonably reliable tool for detecting bovine tuberculosis.