植物病程相关蛋白PR10研究进展

PR（pathogenesis related protein）蛋白产生与积累是植物体应答生物或非生物胁迫的主要特征之一。近年来大量PR蛋白被鉴定,根据它们的结构,亲源关系和生物活性,被分为17个功能家族。PR10蛋白具有核酸酶相似结构,一般为分子量16～19kD的酸性蛋白。近年来相关研究表明一些PR10蛋白具有核酸酶活性和体外抗菌活性,在植物防御反应中发挥重要作用,具有较为广泛的应用前景。本文就PR10蛋白的生理功能、基因结构、表达调控及其与植物抗病的关系等方面的最新研究进展作一综述,并结合本实验室工作展望其在植物抗性育种方面的应用前景。     

灌水量对大麦籽粒蛋白质及其组分含量的影响

研究在大田条件下灌水量对大麦籽粒蛋白质及其组分含量的影响。结果表明:不同灌水量对大麦籽粒蛋白质性状的效应不明显;品种与灌水量的互作对大麦籽粒醇溶蛋白的作用达到显著水平;不同品种间在蛋白质及其各组分含量上均有不同程度的差异。说明大麦籽粒蛋白质性状的水分生理不敏感,对水分条件的适应性较强。     

烟粉虱模式识别受体βGRPs的先天免疫应答

为探索烟粉虱的β-1,3-葡聚糖识别蛋白(BtβGRP)在烟粉虱先天免疫过程中的重要作用,对烟粉虱中鉴定的3个BtβGRPs基因编码的蛋白质进行结构分析,并与其它物种的23个同源蛋白进行系统进化分析,同时通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测分析球孢白僵菌侵染烟粉虱不同虫态不同时间点后BtβGRPs的时间表达模式。结果显示:经鉴定3个BtβGRPs蛋白序列均含有βGRP家族特有的保守性结构域,即糖苷水解酶活性结构域;且3个BtβGRPs独自聚在进化树的一支上,可能参与烟粉虱特有的级联路径;3个BtβGRPs基因在不同虫态和不同诱导时间点与对照相比,除BtβGRP3在卵期未表达外,均有上调表达趋势,但诱导程度不同;成虫诱导24~36 h后达到峰值,比卵和若虫稍晚,可能是由于烟粉虱成虫体表有白色蜡粉等物质,延迟了球孢白僵菌对虫体的侵染。研究表明3个BtβGRPs蛋白可能参与了烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,有可能成为烟粉虱生防的新靶标。     

New insights into radiata pine seedling root infection by Fusarium circinatum

Pine root infection by Fusarium circinatum has been reported in the literature, but the underlying pathogenic interaction is poorly understood. A green fluorescent protein (GFP)‐tagged F. circinatum isolate, together with confocal microscopy, was used in order to monitor the events associated with root infection of Pinus radiata seedlings. It was found that in order to reach and successfully infect pine roots, F. circinatum employed features that are similar to those previously described for other root‐infecting pathogens, such as mycelial strands, single runner hyphae and simple hyphopodia as well as other features that are reminiscent of those that are known to be involved in biotrophic invasion, such as bulbous invasive hyphae and filamentous invasive hyphae. Abundant sporulation was observed at the root surface as well as inside tracheids both in roots and in the root collar region. The fungus can spread from the roots to the aerial parts of the plant, and once there, colonization appears to be similar to the process that occurs when the pathogen is inoculated in the stem. Wilting symptoms and plant demise may be the result of a reduction in water uptake by roots and of the blockage of the vascular system by fungal hyphae and resin.     

取食Cry3Aa蛋白后黄曲条跳甲成虫中肠组织的病理变化

为明确Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫的致死效果及作用机理,采用浸叶法测定了黄曲条跳甲成虫取食Cry3Aa蛋白后的死亡情况,并利用透射电镜观察了Cry3Aa蛋白处理后成虫中肠组织的病理学变化。结果显示,取食浓度为2 mg/mL的Cry3Aa蛋白6 d和12 d后黄曲条跳甲成虫的死亡率分别为33.33%和77.78%;透射电镜观察发现,蛋白处理后成虫中肠发生了明显的病理变化,并且随着时间的延长,病理变化更加明显,主要表现为：柱状细胞变形、细胞间隙增大、微绒毛缩短并肿胀、线粒体变形、内质网肿胀。本研究表明黄曲条跳甲成虫中肠是Cry3Aa蛋白的重要作用部位,研究结果为揭示Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫的作用机理奠定了基础。     

猕猴桃种传潜隐病毒外壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

猕猴桃种传潜隐病毒(actinidia seed borne latent virus, ASbLV),属于乙型线状病毒科Betaflexiviridae李属病毒属Prunevirus,是一种在我国猕猴桃上广泛发生的病毒。本研究通过RT-PCR方法克隆ASbLV的外壳蛋白基因,并连接到原核表达载体pET28a(+)上,转化大肠杆菌Rosetta (DE3),经IPTG诱导后可表达分子量约为28 kD的融合蛋白。经过Ni²⁺-NTA树脂纯化融合蛋白,然后以其为抗原制备多克隆抗体。Western blot结果表明,多克隆抗体的效价为1∶4 000。该多克隆抗体只与ASbLV发生特异性反应,而不与猕猴桃病毒1、猕猴桃病毒A、苹果茎沟病毒、柑橘叶斑驳病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒发生反应,说明该多克隆抗体特异性良好。利用间接ELISA对36份猕猴桃田间样品进行了ASbLV检测,检测结果表明其中20份样品被ASbLV侵染,且间接ELISA检测结果与RT-PCR检测结果一致。本研究建立的间接ELISA方法能够有效地应用于猕猴桃田间样品中的ASbLV检测。     

草莓镶脉病毒外壳蛋白抗原表位预测、克隆、表达及鉴定

为实现草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的简单和快速检测,应用生物信息学方法分析了SVBV外壳蛋白的线性抗原表位及其理化性质,以大肠杆菌的优势密码子对所预测的优势抗表原位进行设计并合成,同时进行了最佳异源表达条件优化。结果表明,第218~238位的氨基酸残基序列为SVBV外壳蛋白的优势抗原表位,其编码片段为5-AE。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测结果表明,重组融合蛋白的分子量约为24.8 kD,与其理论分子量20.5 kD基本一致。异源表达优化的结果表明,当IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度为40℃、诱导时间为4 h时,重组融合蛋白的表达量最高,为23.6 mg/L。Western blot结果表明重组融合蛋白能与His多克隆抗体起特异性反应。串联质谱结果表明,5-AE肽段氨基酸残基序列正确。     

烟草PR10蛋白生物活性及赤星病菌Alternaria alternata诱导下的表达分析

为深入研究植物PR10蛋白的生物学功能,以烟草PR10蛋白(NtPR10)为研究对象,采用冷休克蛋白表达载体p Cold II,构建烟草PR10融合蛋白原核表达系统,优化表达及纯化条件,获得高纯度NtPR10融合蛋白;分别采用底物法和滤纸片法体外分析其核酸酶活性及抑菌活性;并利用荧光定量PCR方法分析了烟草赤星病菌Alternaria alternata侵染下,NtPR10基因在抗、感烟草品种内不同时间点的表达差异。结果表明,15℃、0.1 mmol/L IPTG过夜条件下可诱导获得大量可溶性目的蛋白,50、100 mmol/L咪唑缓冲液洗脱能够获得较高纯度的目的蛋白;纯化后的NtPR10蛋白能够降解烟草总RNA,具有核酸酶活性,且1.0、0.5、0.25μg/μL的NtPR10蛋白溶液均对烟草赤星病菌的菌丝生长具有显著的抑制作用,但随着蛋白浓度的降低,抑菌作用减弱;荧光定量PCR结果显示,接种烟草赤星病菌后,NtPR10基因在感病品种和抗病品种中均显著上调表达,但其在抗病品种的响应速度和表达量显著高于感病品种,表明NtPR10应答了烟草赤星病菌的侵染过程。     

转基因玉米表达的Cry1Ab、PAT和EPSPS蛋白对日本通草蛉幼虫的安全风险评估

为评价我国自主研发的转基因玉米表达的Cry1Ab、PAT和EPSPS蛋白对日本通草蛉Chrysoperla nipponensis幼虫生长发育的安全风险,通过将外源蛋白混入日本通草蛉人工饲料中的方法,以加入砷酸二氢钾(KH_2AsO_4)的饲料为阳性对照,研究了日本通草蛉幼虫取食后的生长发育状况。结果表明:日本通草蛉取食含Cry1Ab和EPSPS蛋白饲料的幼虫发育历期、茧期、结茧率、羽化率及成虫体重等生物学参数与取食正常饲料处理相比均没有显著差异;而取食含PAT蛋白饲料的幼虫发育历期和结茧率分别为10.7 d和96.6%,与取食正常饲料的对照11.1 d和89.9%差异显著,即饲料中添加PAT蛋白显著提高了幼虫的存活率和发育速率;取食含KH_2AsO_4饲料的日本通草蛉幼虫不能存活到茧期,说明KH_2AsO_4具有显著的杀虫活性。ELISA检测结果表明,取食了分别添加有3种外源蛋白饲料的日本通草蛉幼虫体内可以检测到相应的Cry1Ab、EPSPS和PAT蛋白,含量分别为2 758.8~5 210.7、35 018.0~54 426.6、16.8~149.8 ng/g。表明转基因玉米所表达的Cry1Ab、EPSPS和PAT蛋白对日本通草蛉幼虫没有显著的不利影响。     

葡萄病毒B CP基因植物表达载体构建及烟草遗传转化

葡萄病毒B Grapevine virus B(GVB)是葡萄皱木复合病中栓皮病的病原,为开展抗GVB转基因研究,本研究利用RT-PCR技术克隆GVB外壳蛋白(coat protein,CP)基因,与植物表达载体pRI 101-AN连接构建植物表达载体pRI-GVB CP。采用电击转化法将植物表达载体pRI-GVB CP导入农杆菌LBA4404,并利用农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因导入西方烟‘37B’。共获得16个烟草再生株系,PCR检测其中3个株系为阳性,阳性株系播种获得的64株T_1代植株中有30株扩增到目的条带,阳性率为46.9%,表明目的基因GVB cp成功导入烟草并可成功遗传到子代。28株T_1代转基因植株接种病毒进行抗病性鉴定,其中有6株对接种病毒GVB具有抗性。