Identification of pregnancy-associated glycoproteins and alpha-fetoprotein in fallow deer (Dama dama) placenta

Background

This paper describes the isolation and characterization of pregnancy-associated glycoproteins (PAG) from fetal cotyledonary tissue (FCT) and maternal caruncular tissue (MCT) collected from fallow deer (Dama dama) pregnant females. Proteins issued from FCT and MCT were submitted to affinity chromatographies by using Vicia villosa agarose (VVA) or anti-bovine PAG-2 (R#438) coupled to Sepharose 4B gel. Finally, they were characterized by SDS-PAGE and N-terminal microsequencing.

Results

Four distinct fallow deer PAG (fdPAG) sequences were identified and submitted to Swiss-Prot database. Comparison of fdPAG with PAG sequences identified in other ruminant species exhibited 64 to 83% identity. Additionally, alpha-fetoprotein was identified in fetal and maternal tissues.

Conclusion

Our results demonstrate the efficacy of VVA and bovine PAG-2 affinity chromatographies for the isolation of PAG molecules expressed in deer placenta. This is the first report giving four specific amino acid sequences of PAG isolated from feto-maternal junction (FCT and MCT) in the Cervidae family.     

伪狂犬病病毒gE囊膜糖蛋白主要抗原表位区基因的原核表达

参照GenBank上公布的伪狂犬病病毒gE基因序列设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含gE主要抗原表位编码区的564 bp的片段,扩增产物克隆于pMD18-T vector中,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游,构建的原核表达质粒pET-gE在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示:表达产物分子质量为38 ku,以包涵体的形式存在,表达产物用His亲和层析柱进行纯化。Western blotting分析表明:该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应。结果证明该表达产物具有生物学活性,可作为鉴别诊断的抗原。     

丹参糖蛋白的提取精制及其理化性质研究

采用单因子试验和L^9（3^4）正交试验设计，研究料液比、提取时间、提取温度和NaCl浓度对丹参糖蛋白提取率的影响。结果表明，提取物是糖含量为26．24％、蛋白质含量为37．34％的通过O-糖肽键连接的酸性糖蛋白；最佳提取工艺条件：料液比1：20，提取温度70℃．提取时间4h，0．1mol／L的NaCl；Sevage法脱蛋白7次，80％乙醇醇析，可得精制糖蛋白5．03％。     

一株犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组测序与其遗传变异分析

为分析本实验室分离的犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组序列与其遗传变异情况,对CPIV-BJ01株全长进行分段扩增并测序,拼接获得全基因组序列,与GenBank发布的27株副流感病毒5型分别进行全基因组和包膜糖蛋白(F、SH和HN)核苷酸及氨基酸序列的相似性比对,分析其遗传进化关系。结果显示,CPIV-BJ01毒株与犬源PIV5 1 168-1亲缘关系最近,核苷酸相似性为99.9%,氨基酸相似性为99.8%。CPIV-BJ01的F和HN基因序列变化较为保守,核苷酸和氨基酸变化均在4%以内,其中F蛋白的氨基酸变化形成一处新的O-糖基化位点;CPIV-BJ01株的SH基因序列与其他演化分支毒株差异显著,核苷酸相似性为84.4%~97.0%,氨基酸相似性为31.8%~95.6%。综上,CPIV-BJ01株基因组序列与前人报道的毒株相比,在F、HN基因和部分非编码区存在核苷酸或氨基酸序列的改变,同时F蛋白存在糖基化修饰的改变,均为该毒株所特有,该研究结果丰富了中国CPIV流行株的基因组信息。     

狂犬病病毒糖蛋白转基因小鼠对该病毒形成免疫耐受

对带有绵羊ＭＴ启动子－狂犬病病毒糖蛋白基因的（ＭＴ－Ｒｇｐ）的ＴｇＮ（ｏＭＴ－Ｒｇｐ）２Ｌｇｅ、ＴｇＮ（ｏＭＴ－Ｒｇｐ）４Ｌｇｅ和ＴｇＮ（ｏＭＴ－Ｒｇｐ）６Ｌｇｅ３株转基因小鼠系（子代）进行了表达检测。ＥＬＩＳＡ结果表明，小鼠肝脏、肾脏中均有糖蛋白表达产物，以肝脏的表达量较高；对肝脏的免疫组化检测结果显示，糖蛋白分布在肝脏实质细胞，主要位于细胞膜上和胞浆内。对８只ＴｇＮ（ｏＭＴ－Ｒｇｐ）２Ｌｇｅ子代鼠一次接种灭活的狂犬病病毒８２０２株，接种前和接种后３周的血清抗体水平变化在转基因鼠和非转基因鼠之间有明显区别，非转基因鼠抗狂犬病病毒抗体水平明显升高，而转基因鼠抗体水平基本保持不变。经统计学分析，转基因鼠的抗体水平变化相差不显著，表明转基因小鼠对该病毒形成了部分免疫耐受性。     

狂犬病无毒疫苗株SRV_9G基因主要功能区的序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出了狂犬病无毒疫苗株（ＳＲＶ９）糖蛋白（Ｇ）基因膜外主要功能区的两个片段，共约７４０个ｂｐ（４５０～１１４４），含有可以诱导中和抗体的两个抗原决定簇和决定毒力及与神经细胞受体结合部位的基因片段。通过平端连接将两片段克隆到ｐＵＣ１８的ＳｍａＩ位点。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。将这一序列与已发表的狂犬病病毒ＳＡＤＢ１９株的相应序列通过计算机进行比较分析。结果证明两者核苷酸序列的同源性为９８．６％，推导氨基酸序列的同源性为９５．９％，主要抗原区内的几个重要氨基酸（如３３３位精氨酸等）发生了变异，糖基化位点也改变。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核细胞表达产物单克隆抗体的制备

用大肠杆菌 BL2 1表达了马立克氏病病毒 (MDV)强毒 GA株的囊膜糖蛋白 B(g B)基因 ,通过 SDS- PAGE电泳分离表达蛋白条带 ,切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过 EL ISA和间接免疫荧光试验 (IFA) ,得到 1株阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株 7C8。该单抗腹水的 EL ISA效价为 1∶ 2 1 2 ,IFA效价为 1∶ 80 0 ,与 MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、6 48A株感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)均呈 IFA阳性。1∶ 10 0稀释时与 GA株感染的 CEF在斑点酶联免疫吸附试验 (dot- EL ISA)中呈阳性。     

应用聚合酶链反应检测伪狂犬病病毒DNA

选用标准的伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）闽Ａ株，经ＢＨＫ２１细胞培养，提取ＰＲＶＤＮＡ作为摸板；合成１对２０－ｍｅｒ寡核苷酸作为引物；选择扩增序列由２６２个碱基对组成的位于编码多糖蛋白ｇｐ５０基因，用耐热的Ｔａｑ－ＤＮＡ聚合酶经３０个循环以后，扩增的产物直接用凝胶电泳检测，并用标准分子量确定。结果表明：以ＰＲＶＤＮＡ作为模板进行扩增，有扩增产物生成，以同科的疱疹病毒ＤＮＡ作为模板在相同的条件下进行ＰＣＲ扩增，无扩增产物生成，说明ＰＲＶＰＣＲ扩增是特异的。ＰＣＲ技术检测ＰＲＶＤＮＡ敏感度为２８．５ｐｇ．ＰＲＶＰＣＲ技术的建立，为伪狂犬病诊断和流行病学研究提供了更敏感、可靠的手段。