三种PCR方法诊断猪伪狂犬病的比较研究

针对伪狂犬病毒gD基因的不同片段设计三对引物，分别进行PCR扩增用于猪伪狂犬病的诊断，扩增的三个片段的长度分别为262bp、217pb以及1203bp的全基因。通过比较发现，这三种PCB诊断方法均具有很高的特异性和敏感性，值扩增gD基因内部262bp的PCR诊断方法种具有突出优点，其退火与延伸合成一步，其操作可于1h内完成，敏感性更高，更适于猪伪狂犬病的快速诊断。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因截短表达及其抗血清制备

gD糖蛋白是IBRV感染细胞的主要分子,在病毒吸附和侵入宿主细胞中发挥着重要作用。利用IBRV基因组DNA为模板,经生物学软件DNAstar分析主要抗原区,PCR扩增gD基因786bp片段,定向连接到pET32a(+)表达载体中,筛选阳性克隆转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达部分可溶的重组蛋白。Ni-NTA非变性纯化系统纯化蛋白,纯化的蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,利用间接ELISA法检测抗血清效价为1∶6400;同时以该血清进行血清中和病毒实验,中和指数为1∶640,显示该抗血清具有良好的抗病毒能力,为进一步开发牛传染性鼻气管炎(IBR)的诊断检测试剂和疫苗奠定了重要基础。     

鸭肠炎病毒gL蛋白在鸡胚成纤维细胞中动态表达的检测

为研究鸭肠炎病毒(DEV)gL蛋白在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程中的表达情况,本研究以DEVClone-03基因组为模板,应用PCR方法分别扩增得到截短的(gLt,181 bp～711 bp)和全长的gL(1 bp～711 bp)两个基因片段。将gLt基因片段克隆至pET-30a原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化复性,免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗gL蛋白多克隆抗体。同时将全长gL基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA-gL,转染293T细胞。采用获得的抗gL蛋白抗体检测DEV感染CEF后及真核表达质粒pcDNA-gL转染293T细胞后gL蛋白在不同时间点的表达情况。结果表明,在pcDNA-gL转染293T细胞后12 h应用western blot方法能够检测到gL蛋白的表达,其表达量随着转染时间增加而增加;在病毒感染CEF后24 h应用间接免疫荧光方法能够检测到gL蛋白少量的表达,western blot方法在病毒感染CEF48 h后检测到gL蛋白的表达,其表达量随着病毒感染时间增加而增加。上述结果提示,编码gL蛋白基因可能是病毒复制的晚期表达基因。     

鸡传染性喉气管炎病毒姻台株gB基因的序列测定及其结构功能分析

研究以鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）烟台株为模板，PCIK扩增出1条约2．7的gB基因片段，并将其克隆到pMD18-T载体中。序列测定显示，gB基因长2622bp，包含完的阅读框架。序列比较分析发现，烟台株和王岗株、河北株的班基因核苷酸序列与SA2株的比均在第89位上缺失1个碱基G，而在第102位核苷酸处插入1个碱基A，从而引起氨基酸序中第29-32位5个氨基酸的移码突变。烟台株还有另外7个碱基发生突变，使得其班基因与北株、王岗株、SA2疫苗株的gB基因核苷酸同源性分别为99．8％、99．7％和99．6％，氨基酸的同性分别为99．4％、99．4％、98．9％，表明不同ILTV毒株之间gB基因是非常保守的。划型相列河源     

狂犬病病毒糖蛋白转基因小鼠的构建研究

将狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡ ＢｇｌⅡ（１．６７ｋｂ）片段正向插入ｐＭＴ０１０／Ａ＾＋ＢａｍＨⅠ切点，构建重组质粒ｐＭＴ０１０／Ａ＾＋－Ｒｇｐ，用ＥｃｏＲⅠ＋ＳａｌⅠ对ｐＭＴ０１０／Ａ＾＋－Ｒｇｐ进行双酶切后，回收含有狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡ和绵羊ＭＴ启动子的２．７６ｋｂ片段，通过显微注射技术将该片段注入小鼠单细胞受精卵雄前核内，在进行胚胎移植后，获得４４只小鼠，经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及原位     

Two Akabane virus glycoprotein Gc domains induce neutralizing antibodies in mice

Akabane virus (AKAV), belonging to the genus Orthobunyavirus and family Peribunyaviridae, causes reproductive and congenital abnormalities in ruminants. Its envelope glycoprotein Gc is a neutralizing antigen, on which at least five distinct antigenic regions have been identified. We attempted to identify the domains using truncated recombinant AKAV Gc proteins expressed in Escherichia coli and monoclonal antibodies (mAbs) with AKAV-neutralizing activity. Dot blot analysis revealed that amino acid positions 1–97 and 189–397 (Gc_1–97 and Gc_189–397) in the truncated recombinant proteins reacted with the mAbs. Additionally, AKAV was neutralized by sera from mice immunized with these recombinant proteins. The results suggested that the two domains contain neutralizing epitopes and could be potential subunit vaccines against AKAV.     

表达猪瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK-15细胞系构建

将克隆到pGEM T-easy载体中的E0基因双酶切回收后，连接到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）中，利用Lipofectamine^TM2000将重组子转染PK-15、BHK-21、VERO 3种细胞，直接在荧光显微镜下用蓝光激发进行观察，在3种细胞中都可以观察到绿色荧光，而且在转染后的24、48、72 h 3个时间点上，观察到的荧光细胞数量逐渐增多，在72 h时荧光细胞的数量在3种细胞中都达到最多，总的来看，在PK 15中荧光细胞的数量最多。通过对细胞荧光的定位发现，重组质粒的荧光主要分布在胞浆内，而且细胞核周围的荧光较强，胞核与胞浆的界限明显，尤其是在PK-15细胞和VERO细胞中这种现象尤为明显。未携带E0目的DNA的pEGFP-N1 Vector转染3种细胞后，都可以观察到绿色荧光，但是整个细胞中是均匀出现荧光的。经酶切、PCR、单抗间接免疫荧光检测，PK-E0细胞中有大量的HCLV的E0表达，单纯的PK-15细胞中没有E0的表达。HCLV株在PK-E0细胞中从48h开始到72h的滴度比在PK-15细胞中的滴度要高。证明PK-E0细胞中E0蛋白的大量表达增加了HCLV在细胞中的复制。     

牛妊娠相关糖蛋白ELISA对早期妊娠诊断效果的影响

选取273头荷斯坦奶牛,在人工输精后的28d和75d分别采用牛妊娠相关糖蛋白(PAG)ELISA和直肠检查的方法进行妊娠诊断,比较PAG ELISA和直肠检查法的结果,旨在评价PAG ELISA对配种28d的奶牛进行早期妊娠诊断的准确性。结果表明,PAG ELISA法妊娠诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%,与75d直肠检查结果相同,可用于母牛的早期妊娠诊断。妊娠诊断对于母牛保胎、分群管理及提高繁殖效率等具有非常重要的意义。     

J亚群禽白血病病毒gp37基因的克隆和序列分析

近两年我们从国内不同省份先后分离和鉴定了8株J亚群禽白血病病毒（ALV-J），并对其中的5株进行了gp37基因的克隆和序列分析，结果表明，我们分离的5株ALV-J之间的同源性为94.6%-99.0%；与国内最早分离的SD9901，SD9902和YZ9901等毒株之间的同源性分别为95.3%-98.5%,95.6%-99.0%和94.9%-98.6%；与国际最先报道的原型株HPRS-103之间的同源性为93.4%-95.1%；与其它国外毒株的同源性为92.7%-96.8%。这表明我国ALV-J的gp37基因正在不断发生变异，但相对于gp85基因的变异性要小。     

水疱性口炎病毒糖蛋白基因的克隆和表达

对一株实验室保存多年的水疱性口炎病毒(VSV)的囊膜糖蛋白(VSV_G)基因进行了克隆和测序,并且构建了重组VSV_G真核系统表达载体。结果表明克隆的VSV_G基因全长1536个核苷酸(nt),其编码的G蛋白长为511个氨基酸(aa),氨基酸序列与20个Indiana血清型VSV毒株的同源性在95.4%左右(94.1%～98.0%)。种系发生树分析表明此病毒株属于水疱病毒属的VSV_Indiana血清型。经免疫荧光检测证明构建的重组VSV_G表达质粒pCIVG5和pCRVG6转染23T细胞后能够有效地转录和表达,这为进一步开发利用VSV_G奠定了基础。