鸡传染性喉气管炎病毒姻台株gB基因的序列测定及其结构功能分析

研究以鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）烟台株为模板，PCIK扩增出1条约2．7的gB基因片段，并将其克隆到pMD18-T载体中。序列测定显示，gB基因长2622bp，包含完的阅读框架。序列比较分析发现，烟台株和王岗株、河北株的班基因核苷酸序列与SA2株的比均在第89位上缺失1个碱基G，而在第102位核苷酸处插入1个碱基A，从而引起氨基酸序中第29-32位5个氨基酸的移码突变。烟台株还有另外7个碱基发生突变，使得其班基因与北株、王岗株、SA2疫苗株的gB基因核苷酸同源性分别为99．8％、99．7％和99．6％，氨基酸的同性分别为99．4％、99．4％、98．9％，表明不同ILTV毒株之间gB基因是非常保守的。划型相列河源     

Ⅰ型鸭肝炎病毒SH株全基因组序列测定与分析

本研究从上海市某鸭场发病鸭群中分离到1株DHV-1型强毒株,对其进行毒价测定、琼脂扩散试验和动物回归实验,结果显示：按103.41 ELD50/0.2 mL接种1日龄雏鸭,该毒株对雏鸭有明显的致病性,死亡率为60%,肝脏病变率为100%。经全基因组测序显示：该毒株长度为7652 nt,含626 nt的5＇非编码区和314 nt的3＇非编码区,编码一个2249 aa大小的多聚蛋白。根据Blast比对发现,该毒株属于经典的DHV-1A群,与韩国经典强毒株R85952（99.7%）和中国分离强毒株HP-1（99.3%）的同源性最高。     

鸭肝炎病毒VP1蛋白B细胞抗原表位预测及变异分析

以鸭肝炎病毒(DHV)SN株VP1基因序列为基础,运用Garnier-Robson、Chou-Fasman和Karplus-Schulz方法预测VP1蛋白的二级结构,并分别运用Kyte-Doolittle方法、Jameson-Wolf方法和Emini方法预测蛋白的亲水性、抗原指数和表面可及性,最后结合吴玉章的方法综合分析预测其B细胞抗原表位.结果显示,VP1蛋白C端第132～137、177～186、209～219区段有较好的亲水性、表面可及性和较高的抗原指数,并且在二级结构上含有易形成抗原表位的无规则卷曲和β-转角,可能是VP1蛋白的B细胞抗原优势表位;DHV SN株与弱毒疫苗株在推测的VP1 B细胞抗原表位177～186和209～219两个区域氨基酸序列变异较大.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）早期检测方法,本研究利用逆转录环介导恒温扩增技术（RT-LAMP）,针对PRRSV的ORF5基因片段设计了4条引物,利用Bst DNA聚合酶在65 ℃恒温条件下进行逆转录扩增,通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和加入SYBR Green Ⅰ染料肉眼判断结果,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。结果表明,该检测方法具有良好的特异性,与其他常见病毒如猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒等无交叉反应,较普通RT-PCR灵敏性高100倍。采用RT-LAMP和RT-PCR分别对10份临床样本同时进行检测,符合率为100%。因此,本研究建立的RT-LAMP是一种可适用于临床PRRSV检测的快速、简单、灵敏、特异的检测方法。     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物     

犬传染性肝炎病毒的血凝抑制抗体和中和抗体的关系

犬传染性肝炎病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｃａｎｉｎｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ，ＩＣＨＶ）能诱导动物机体产生中和（Ｓｅｒｕｍ　ｎｅｕｔｒｏｌｉｚａｔｉｏｎ，ＳＮ）抗体与血凝抑制（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＨＩ）抗体，本研究对８份ＩＣＨＶ免疫的犬血清同时进行了其ＳＮ抗体和ＨＩ抗体的检测，结果表明ＳＮ抗体和ＨＩ抗体具有正比线性关系ＳＮ≈８×ＨＩ，并绘制了标准曲线。由于血凝和ＨＩ试验不需应用活的试验宿主系统，而且可在３　ｈ内获得结果，操作经济简便，因此可通过测定ＨＩ抗体的效价来推算出ＳＮ抗体效价。     

一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。     

鸭坦布苏病毒E蛋白具有独特交叉反应性中和表位的鉴定

利用抗鸭坦布苏病毒(DTMUV)中和单抗1G2,结合E蛋白多肽扫描技术,鉴定了最小抗原表位²²⁷GSSAGTWQN²³⁵。Western blot显示,残基²³¹G或²³³W的突变后,表位完全失去了与1G2抗体识别的功能,表明²³¹G或²³³W是抗体1G2识别的关键氨基酸位点。通过免疫荧光分析(IFA)显示,MAb 1G2与JEV、WNV和ZIKV的E蛋白发生交叉反应,表明该表位是黄病毒的交叉反应性表位。蛋白质和病毒模型显示,表位定位于成熟病毒粒子可接近的表面,在E蛋白结构域Ⅱ的hi环中。本研究首次证明,中和抗体1G2靶向交叉反应表位定位在E蛋白结构域Ⅱ的hi环,该表位的鉴定有助于提高对黄病毒血清诊断中存在交叉反应问题的认识和理解。     

口蹄疫重组鸡痘病毒活载体疫苗在豚鼠、猪体内的毒性、分布及抗体消长规律

利用临床观察、病理解剖、PCR、RT-PCR、ELISA、中和抗体检测等方法,对口蹄疫(FMD)重组鸡痘病毒(FPV)在豚鼠、仔猪体内的毒性、分布以及抗体消长规律进行研究。结果表明,FMD重组鸡痘病毒免疫的动物在整个试验期间,未表现出明显的临床症状和不良反应;病理组织切片检测无明显的组织学变化;PCR、RT-PCR检测证明,豚鼠、猪免疫FMD重组鸡痘病毒后,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脑、肠系膜淋巴结内检测到FPVDNA和FMDV DNA,且在大部分组织能存在3 d左右;FMD重组鸡痘病毒均可诱导免疫动物产生较高水平的抗FMDV特异性抗体和中和抗体,验证了所构建重组FPV的生物安全性及良好的免疫原性,为其他哺乳动物实验提供了必要的基础数据。     

应用单克隆抗体的免疫组织化学法研究雏鸭体内鸭瘟病毒的分布

本实验应用了免疫组织化学的单克隆抗体间接酶标染色法，对人工感染鸭瘟病毒雏鸭的组织切片进行染色观察。旨在研究病毒在鸭体内分布，对其进行定位。研究结果显示，鸭的心脏、肝脏、脾、胸腺、肠、法氏囊、胰、肺、肾等组织的细胞浆内均出现了染色的特异阳性反应物。结果表明，鸭瘟病毒广泛分布于感染雏鸭的各种组织器官，并造成一定的组织病理变化。