PRV、PCV2与PPV三重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)与猪细小病毒(PPV)的三重PCR方法,根据Gen Bank登录的病毒相关基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上3种病毒的PCR诊断方法,扩增的目的片段长度分别为192 bp(PRV)、255 bp(PCV2)和759 bp(PPV)。对PRV、PCV2和PPV的核酸检测最低浓度分别为:2.5×10-2,2.2×10-3和3.7×10-2ng,证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性。应用该方法对56份临床样品进行检测发现,PRV、PCV2和PPV的阳性率分别为16.1%、50.0%和19.6%,二重感染率为12.5%,三重感染阳性率为3.6%。该方法的成功建立为快速高效地检测以上3种病毒提供了有效手段。     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）0RF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92．1％～99．9％之间，推导的氨基酸序列同源性在90．2％～99．5％之间。     

猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因的检测及序列分析

根据猪链球菌2型(strep tococcus su is type 2)溶血素基因(sly)设计和合成了一对可扩增其完整阅读框的引物,对HA 9801等6株猪链球菌2型江苏分离株、1株德国分离株SS2-D及猪链球菌C群参考株ATCC 35246的核酸进行PCR扩增,结果显示HA 9801等6株江苏分离株及德国株SS2呈阳性,ATCC 35246呈阴性。HA 9801株PCR产物纯化后测序,序列分析结果表明该DNA片段与猪链球菌2型1933株的sly基因同源性为99%。     

三种猪Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的三种猪Ⅰ型干扰素（porcine interferon,pIFN）基因序列,设计了3对特异性引物。运用RT—PCR技术从长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到了三种猪干扰素基因,并将其克隆至pGEM-T Easy载体上。序列测定结果显示,获得的猪干扰素α1基因序列全长570bp,编码189个氨基酸,获得的猪干扰素α2基因序列全长540bp,编码179个氨基酸,获得的猪干扰素β基因序列全长563bp,编码186个氨基酸。三种猪Ⅰ型干扰素基因与已知猪Ⅰ型干扰素核苷酸序列和氨基酸序列的相似性最高可达99％～100％。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达与抗原性分析

研究分析了O型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1与当前猪FMDV疫苗血清的免疫反应性.将VP1基因克隆至原核表达载体pET32c,并在大肠埃希菌BL21中得到了表达,Western blot分析表明该重组蛋白与豚鼠O型FMDV标准阳性血清具有良好免疫反应性.目的蛋白经纯化后用ELISA分析其与猪疫苗血清的免疫反应性,结果显示该重组VP1蛋白(rVP1)只能与部分O型FMDV疫苗血清反应.推测当前使用的不同O型FMDV疫苗毒株在VP1重要中和抗原位点G-H环(134 aa～158 aa)与C末端(200 aa～213 aa)存在较大差异.     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸检测标准物质的制备研究

针对目前口蹄疫病毒核酸扩增检测缺乏标准物质的现状,以口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型核酸为模板,分别设计引物扩增具有检测意义的5′端1nt～2208nt的片段(含完整的5′NCR)和3012nt～5155nt片段(含完整1D～2B区域),并克隆于pMD20-T。测序后采用体外转录方法制备2种RNA纯品,进行初步定量稀释后等量混合分装。采用荧光定量RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检验后,委托外部实验室对RNA片段进行拷贝数定值。结果显示,制备的标准品均匀性和稳定性良好。     

猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究

PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3．1（＋），构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，命名为pCORF2BVP22和pCBVP220RF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠，分别注射pCDNA3．1（＋）、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP220RF2，共免疫2次，间隔2周，分别于首免后2周和二免后4周采血，ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达，将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体，构建了pNORF2和pNBVP22，转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示，通过两次免疫后，各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体，同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。     

2011年-2013年滨州及其周边地区4种猪病毒性疾病的流行情况分析

通过对滨州及其周边地区2011年-2013年316个场次采集病料进行猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒与猪圆环病毒2型的检测,并对检测结果进行了统计分析,了解滨州及其周边地区上述4种疫病的流行状况。     

鸽源Ⅰ型禽副黏病毒HN基因序列测定和分析

以分离自云南省的一株鸽源禽I型副黏病毒YN-P1株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出HN基因片段,然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后,对阳性克隆进行核苷酸序列测定。测序后拼接得出HN基因的全序列。测序结果显示,YNP1毒株HN基因为1 716 nt。通过与参考毒株比较HN基因序列,发现所研究毒株YN-P1与TW95核苷酸序列同源性最高为88.3％;与ZJ1／Go氨基酸序列同源性最高为91.6％。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒SH株全基因组序列测定与分析

本研究从上海市某鸭场发病鸭群中分离到1株DHV-1型强毒株,对其进行毒价测定、琼脂扩散试验和动物回归实验,结果显示：按103.41 ELD50/0.2 mL接种1日龄雏鸭,该毒株对雏鸭有明显的致病性,死亡率为60%,肝脏病变率为100%。经全基因组测序显示：该毒株长度为7652 nt,含626 nt的5＇非编码区和314 nt的3＇非编码区,编码一个2249 aa大小的多聚蛋白。根据Blast比对发现,该毒株属于经典的DHV-1A群,与韩国经典强毒株R85952（99.7%）和中国分离强毒株HP-1（99.3%）的同源性最高。