狂犬病病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

狂犬病病毒为不分节段单链负股的RNA病毒,属弹状病毒科狂犬病病毒属。世界上几乎所有国家都有狂犬病发生,狂犬病病毒能够使所有温血动物发病致死,死亡率高达100%。本研究根据GenBank中的狂犬病病毒M基因序列,选择保守区域设计引物,通过对SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。结果显示,建立的狂犬病病毒实时荧光定量PCR方法,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,是开展狂犬病的临床检测的有力工具。     

家蚕3-羟酰辅酶A脱氢酶基因全长cDNA克隆及其在质型多角体病毒感染家蚕的差异表达

家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）是家蚕的重要病毒病原之一,往往给养蚕业生产造成极大危害。我们以前的研究运用基因芯片技术在感染质型多角体病毒的家蚕中肠中鉴定出一个差异表达的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因（Bombyx mori3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase protein gene-Bm3HAD）。本研究利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆了该基因,其全长cDNA序列为1168bp,包含一个83bp5＇端非翻译区序列（5＇-UTR）、一个930bp的开放阅读框（ORF）和一个155bp的3＇端非翻译区序列（3＇-UTR）;基因结构分析发现该基因由5个外显子和4个内含子组成。RT-PCR结果显示该基因在家蚕中肠、脂肪体、血液、丝腺及生殖体中均有表达。荧光定量PCR结果表明该基因在BmCPV感染初期为上调表达,随着病毒感染的进展,该基因的表达水平逐渐降低,并转变为下调表达。研究结果为进一步研究BmCPV对家蚕致病的分子机制提供了有益的信息。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a（＋）-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B（DE3）中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

水稻南方黑条矮缩病毒湖南鼎城株系S10片段的基因组序列分析

运用RT-PCR技术克隆了水稻南方黑条矮缩病毒（southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）湖南鼎城株系的基因组S10片段（SRBSDV-HuNDCS10）,并对其全序列进行了测定和生物信息学分析。结果显示,SRBSDV-HuNDC S10片段全长为1797bp（登录号：JQ337964）,含有1个ORF,编码557个氨基酸残基的衣壳蛋白,推测分子量约62.6kD,推测等电点为7.62,与已报道的广东、海南和云南分离物病毒的S10作比较,它们的核苷酸相似性分别为99.7%、99.0%和98.4%,氨基酸相似性分别为100.0%、99.5%和99.3%。对SRBSDV-HuNDCS10及部分Fijiviruses病毒对应片段在5＇URT与3＇URT存在的保守序列和互补序列进行了归纳,对其ORF编码的氨基酸序列进行了motif查找,得到该属（Fijiviruses）氨基酸序列的10个保守区段。此外,进行了糖基化位点、磷酸化位点及B细胞抗原表位预测,发现了3个可能的N端豆蔻酰基化位点,可能与病毒的侵染机制有关。     

在毕赤酵母中利用口蹄疫病毒(FMDV)2A实现dTomato和串联MagaininⅡ基因的共表达

抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的多肽,是天然免疫的重要组成部分.为了提高抗菌肽的表达量以及很方便地检测抗菌肽的表达情况,本研究利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A将荧光蛋白dTomato基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中(open reading frame,ORE),融合的基因被置于pPIC9K载体醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9K-dTomato -2A-3M,将线性化的重组酵母表达载体通过电击法转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115中,经G418筛选和PCR鉴定得到阳性转化子,然后将其转至摇瓶,在30℃、0.5％甲醇的条件下进行诱导表达,连续诱导3d.SDS-PAGE电泳图谱显示,在31 kD(dTomato)和9.5kD(3M)处有蛋白条带出现,在荧光显微镜下观察酵母表达上清发出红色荧光,对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽串联的MagaininⅡ具有明显的抑菌效果.结果表明,由2A连接的融合基因(荧光蛋白dTomato和串联的MagaininⅡ)在毕赤酵母中成功的进行了表达,FMDV 2A在其C端剪切多聚蛋白,得到dTomato和串联的MagaininⅡ两个独立而有活性的蛋白,为小分子抗菌肽的表达提供一个高效的检测方法.     

黑番鸭血管活性肠肽受体-1基因(VIPR-1)的cDNA克隆及其组织表达特性分析

最近的研究表明,血管活性肠肽(VIP)与家禽的就巢习性密切相关。本研究采用反转录PCR方法从黒番鸭(Cairina moschata)母鸭下丘脑组织中克隆了血管活性肠肽受体(VIPR-1)基因的cDNA序列,长度为1125bp,编码355个氨基酸(GenBank登录号:JN625215)。序列比对结果表明,该序列与家禽(鸡、火鸡、鹌鹑)和哺乳动物(人、小鼠、猪、牛)的基因序列分别有93%~94%和69%~71%的同源性,而相应氨基酸序列的同源性分别为96%和70%~72%。荧光定量PCR结果发现,黒番鸭VIPR-1基因的表达量在产蛋期、就巢期和休产期差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),就巢期表达量最高,休产期次之,产蛋期表达量最低,表明VIPR-1基因与繁殖阶段变化密切相关;对不同组织VIPR-1的表达量分析发现,VIPR-1在垂体、下丘脑和卵巢中均有表达,其中垂体最多,其次是下丘脑,卵巢中的表达量最低,差异极显著(P<0.01)。研究结果提示,VIPR-1基因具有高度保守性,参与下丘脑-垂体-卵巢轴(特别是垂体)对黑番鸭就巢行为的调控。     

发酵床垫料翻耙结合网床养殖改善鸭舍空气质量与鸭生产性能

为解决规模化肉鸭生产中粪污影响鸭健康和污染环境的问题,研发了一种发酵床结合网床架养新技术及其配套的可移动式网床下发酵床垫料翻耙系统,并研究了该模式在控制舍内气载微生物数量和提高鸭生产性能中的优势。结果显示:1)可移动式发酵床垫料翻耙系统实现不同发酵床体共用一台翻耙机。2)与发酵床平养相比,鸭26日龄之前未翻耙垫料时,发酵床网养舍内需氧菌总数(1.531×105 CFU/m3)和大肠杆菌数量(1.298×104 CFU/m3)显著升高(P0.05);鸭27~34日龄时每4 d翻耙垫料,发酵床网养舍内需氧菌总数(2.304×105 CFU/m3)和金黄色葡萄球菌数量(1.353×105 CFU/m3)显著降低(P0.05);鸭35~39日龄时每天翻耙垫料,发酵床网养舍内需氧菌总数(1.255×105 CFU/m3)和"沙门+志贺"氏菌数量(14.13 CFU/m3)显著降低(P0.05)。3)在发酵床平养舍内,与每4 d翻耙1次垫料相比,每天翻耙1次垫料舍内需氧菌总数(2.688×105 CFU/m3)、大肠杆菌(2.038×104 CFU/m3)、金黄色葡萄球菌(8.90×104 CFU/m3)和"沙门+志贺"氏菌(47.11 CFU/m3)数量显著(P0.05)降低,而在发酵床网养舍内,每天翻耙1次垫料舍内需氧菌总数(1.255×105 CFU/m3)和"沙门+志贺"氏菌(14.13 CFU/m3)数量显著降低(P0.05)。4)与发酵床平养相比,发酵床网养增加鸭体质量(P0.05),降低死亡率和上市淘汰率(P0.05)。结果表明研发的肉鸭养殖新模式能更好地减少舍内空气中病原菌浓度,改善鸭舍内空气环境,提高鸭生产性能。该研究为发酵床结合网床架养新模式在规模企业中推广应用提供技术支持。     

利用机器视觉与近红外光谱技术的皮蛋无损检测与分级

为了对优质蛋、次品蛋和劣质蛋这3种皮蛋进行检测及分级,该文应用机器视觉结合近红外光谱技术,研究利用皮蛋凝胶品质无损检测的分级方法。首先采集皮蛋透射光图像,提取18个图像颜色特征值,然后将所提取的18维特征利用主成分分析(principal component analysis,PCA)进行降维,对PCA降维后的3个主成分建立遗传算法优化支持向量机(genetic algorithm-support vector machine,GA-SVM)分级模型,把皮蛋样本分为两大类:可食用蛋(优质蛋与次品蛋)与不可食用蛋(劣质蛋),劣质蛋测试集识别率为100%。然后在机器视觉分类结果的基础上,利用近红外光谱技术获取可食用蛋(优质蛋与次品蛋)的原始光谱,并进行多元散射矫正(multiplicative scatter correction,MSC),利用竞争性自适应重加权算法(competitive adaptive reweighted sampling,CARS)降维提取特征波长,基于支持向量机(support vector machine,SVM)对特征波长变量建立分级模型,区分出优质蛋与次品蛋,优质蛋测试集识别率为96.49%,次品蛋识别率为94.12%。研究结果表明:基于机器视觉和近红外光谱进行皮蛋凝胶品质无损检测分级是可行的。     

鸭血中SOD的提取及稳定性研究

为充分利用鸭血资源,以新鲜鸭血为原料,利用响应面分析法对鸭血中超氧化物歧化酶(SOD)的提取工艺进行优化,并初步研究了SOD在不同条件下的稳定性。结果表明,乙醇与氯仿的体积比4∶5,溶血球与沉淀剂的体积比1∶1,静置时间25.5 min,SOD比活为1 000.91 U/mg;在pH值4.0～6.0,50℃温度以下SOD具有良好的稳定性。     

一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对马铃薯病毒诊断研究的比较

本研究采用试剂盒和Total试剂两种方法从马铃薯叶片和茎秆中提取总RNA,同时设计了一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的反应体系,依据马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,并运用两种RT-PCR反应体系对染病的马铃薯进行病毒检测,结果与报道的这五种马铃薯病毒核苷酸序列进行BLAST比对, 表明扩增的五种马铃薯病毒靶带的序列与靶序列完全一致。两种诊断方法对马铃薯病毒核酸进行浓度检测,结果证明,两步法RT-PCR具有较高灵敏性。但这两种方法均可快速、简便、有效地诊断马铃薯病毒。