Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of σC Protein of Novel Duck Reovirus DH13 Strain

The aims of the experiment was to optimize the prokaryotic expression system of σC protein,prepare polyclonal antibody against σC protein of novel duck reovirus (NDRV),and evaluate the titer of the antibody.The σC gene of NDRV-DH13 strain was amplified by RT-PCR,ligated into pET-30a(+) and pET-32a(+) expression vector,constructed prokaryotic expression plasmid,which were transformed into E.coli BL21(DE3) and the expression of the σC protein were induced by IPTG.The proteins expression were analyzed by SDS-PAGE.The recombinant protein without His tag was purified by digestion,and the recombinant protein with His-tagged was purified by Ni-NTA column.Then the polyclonal antibody was obtained from rabbits which had been immunized by the purified protein without His tag.Anti-His-labeled mAb and NDRV-σC positive serum were used as primary antibodies to evaluate antibodies specificity,the antibodies titer was detected by indirect ELISA (iELISA).SDS-PAGE results showed that the molecular weight of the expression on recombinant proteins were 34 and 37 ku respectively,the proteins were highly expression.Western blotting showed that they had the specific reaction and the prepared antibodies had higher affinity with σC protein,the titer were about 1:25 600 by iELISA detection.This study successfully constructed and optimized the prokaryotic expression system of the polyclonal antibody against σC protein,laid a foundation for the further study of σC protein and the research of genetically engineered vaccine.     

4株鸭源肠球菌的鉴定和致病性

对临床分离的4株鸭源肠球菌郑1株、郑2株、郑3株、北京株和1株粪肠球菌参考菌株进行了系统鉴定,并用SDS-PAGE和Western-blot技术对各菌株细胞壁蛋白图谱进行比较分析。结果5个菌株的形态、染色、生理生化特性均与粪肠球菌特性一致;它们均对青霉素、万古霉素和庆大霉素敏感而对四环素耐药;5个菌株人工感染雏鸭及小白鼠均有致病性,但各菌株间致病力存在差异,北京株最强,参考株最弱,其余3株介于北京株和参考株之间;各菌株的细胞壁蛋白经SDS-PAGE在相对分子质量33 370~131 690之间均显示数十条蛋白带,其中郑2株和北京株在相对分子质量66 840处均有1条染色较深的蛋白带,而用Western-blot分析显示抗北京株胞壁蛋白抗体只能检测到北京株相对分子质量为66 840的抗原蛋白。以上结果表明,这5个被检菌株为致病性粪肠球菌,且致病性以北京株最强。     

党参和白术对脾虚北京鸭肠道CCK、VIP、SSmRNA表达的影响

采用利血平建立北京鸭脾虚模型,观察健脾益气中药党参和白术对脾虚北京鸭十二指肠和空肠CCK、VIP、SSmRNA表达的影响。结果表明:脾虚组鸭十二指肠和空肠CCK、SSmRNA表达都显著(P<0.05、P<0.01)低于正常组;党参预防组、治疗Ⅱ组以及白术治疗Ⅱ组治疗效果均显著,可使十二指肠和空肠CCK、SSmRNA表达回复到正常水平。说明党参具有预防脾虚的作用,且单独高剂量(中药浓度2g/mL)使用党参和白术能达到治疗脾虚的目的,其作用机理是通过调节胃肠激素在体内的平衡达到治疗脾虚泄泻的目的。     

鸭副黏病毒的分离与鉴定

从广东省某鸭场的病死番鸭肝脏中分离一株病毒,该病毒对雏鸭、种鸭、蛋鸭均可引起发病。接种鸭胚传至第6代时病毒对鸡红细胞的血凝性稳定,通常在72h开始致死非免疫鸭胚,死亡率为80%。经磷钨酸负染电镜观察,病毒粒子多呈现椭圆形,长轴为167～264nm,短轴为131～139nm,病毒外表有囊膜,囊膜外层有排列整齐的纤突。病毒与禽流感病毒无抗原相关性,能被禽副黏病毒I型阳性血清所中和。根据试验结果,初步将分离的病毒判定为鸭副黏病毒。     

番鸭呼肠孤病毒病雏番鸭实质器官的超微结构

对人工感染番鸭呼肠孤病毒发病雏番鸭的心、肝、肺、肾、脾脏、胸腺、法氏囊等7种实质器官的超微结构进行了观察。电镜下发现：心、肝、肺、肾等实质器官出现不同程度的细胞变性、水肿以及局灶性溶解坏死；各器官血管内皮细胞脂滴增多、水肿以至坏死脱落．通透性增加；浆细胞、淋巴细胞和吞噬细胞呈散在或灶性浸润于坏死区和实质细胞间。免疫器官脾脏、胸腺和法氏囊中的部分淋巴细胞、浆细胞坏死和不同程度凋亡，且细胞溶解坏死形成大小不一的坏死灶并被大量增生的吞噬细胞所吞噬，淋巴细胞数量明显减少。上述结果提示，番鸭呼肠孤病毒能导致番鸭免疫抑制。     

绿头野鸭与我国主要地方鸭品种遗传多样性研究

利用17个微卫星标记,采用PCR扩增,8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染,对绿头野鸭种群和我国9个主要地方鸭品种的遗传多样性进行了检测,统计了各群体的平均有效等位基因(Ne)、平均遗传杂合度(H)、多态信息含量(PIC)、群体间的遗传距离(Ds)和相似系数(I)。采用UPGMA和NJ法构建系统发生树。结果表明:17个微卫星座位在绿头野鸭种群和我国9个主要地方鸭品种中的多态信息含量均为高度多态,所有鸭种的平均PIC、H、Ne分别为0.6506、0.6896、4.1±1.5,基因多态性和遗传多样性相对较高;家鸭各品种间的遗传距离在0.1631~0.6844范围内,绿头野鸭与家鸭品种间的遗传距离分别在0.3096~0.8219之间。根据系统发育树推断中国主要地方鸭品种不是单一起源于绿头野鸭。中国主要地方鸭品种大致可以分为5支。一支为北京鸭、荆江鸭,一支为中山鸭、建昌鸭及高邮鸭,一支为靖西大麻鸭和金定鸭,连城鸭为一支,绍兴鸭为另一支。     

鸭生长激素(GH)基因编码区及调控区多态性分析

根据鸭生长激素基因编码区及调控区的序列设计8对引物,利用PCR-SSCP方法对北京鸭、西湖野鸭、樱桃谷鸭、金定鸭、山麻鸭、荆江鸭、绍兴鸭、缙云麻鸭等8个鸭种进行单核苷酸多态性分析。结果共发现3个突变位点,分别为230处（C→G）、244处（C→A）和3 701处（C→T）。前两处突变位于5′调控区,3 701处突变位于编码区第4外显子,但该编码区的突变是沉默突变,3′调控区表现了高度的保守性。统计结果发现：⑴在5′调控区基因座上,金定鸭的等位基因B频率显著高于其他品种;⑵在外显子4基因座上,基因型频率的分布与品种有关,且肉用型鸭的CC基因型频率显著高于蛋用型。可以推测,本研究所检测到的基因座可能与生产性能相关。     

用间接免疫荧光染色法检测鸭病毒性肠炎病毒在人工感染鸭体内的侵染过程和分布规律

用鸭病毒性肠炎病毒（DEV）CHv强毒株感染成年鸭复制鸭病毒性肠炎急性病例,分别于接种后不同时间,取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、食道、十二指肠、胰腺、法氏囊和脑组织,制作切片,应用间接免疫荧光染色法（IFA）检测DEV在鸭体内的侵染过程和分布规律。结果显示：感染后4 h可在脾脏、胸腺和法氏囊中检测到DEV抗原;感染后6 h可在肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏检测到DEV抗原;IFA对各组织器官中DEV的平均检出率为肝脏46/50、脾脏48/50、肺脏46/50、肾脏0/50、肠道46/50、法氏囊46/50、胸腺47/50、胰腺0/50、大脑0/50、食道44/50、心脏0/50。研究表明：在急性病例中,脾脏、法氏囊、胸腺、食道、肠道、肝脏和肺脏为DEV的主要靶器官;接种后,病毒首先在脾脏、胸腺、法氏囊中出现,然后病毒迅速传播到肝脏、消化道和肺脏中;IFA检测石蜡切片中DEV的方法具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的较好方法。     

北京鸭PRLR基因部分序列的克隆及分析

利用PCR方法克隆了北京鸭催乳素受体(PRLR)基因部分序列,该序列长1325bp。序列分析结果表明,该序列由第9外显子的一部分(57bp)、第9内含子(635bp)以及第10外显子的一部分(633bp)组成;在核苷酸水平上,北京鸭的该序列(除去内含子)与鹅(U07694)、鸡(D13154)、野鸽(DQ209271)、火鸡(L76587)的相似性分别为94.2%、88.7%、86.8%、86.1%;在氨基酸水平上,与鹅(ABA71353)、鸡(BAA02439)、野鸽(AAA20646)、火鸡(AAB01544)的相似性分别为93.5%、84.3%、80.8%、80.9%。     

青年期及产蛋期绍兴鸭和康贝尔鸭血清促性腺激素释放激素浓度的比较

采用放射免疫分析法 (RIA)测定了不同日龄 (60 ,10 0 ,2 0 0和 380日龄 )绍兴鸭和卡基 康贝尔鸭 (KhakiCampbellDuck)血清中促性腺激素释放激素 (GnRH)浓度 ,试图通过比较不同品种、性别和日龄鸭之间GnRH浓度的变化 ,探讨GnRH与产蛋性能的关系。结果表明 :绍兴鸭和康贝尔鸭母鸭血清中GnRH浓度呈现类似的年龄性变化 ,60日龄时GnRH浓度较低 ,10 0日龄时最高 ,2 0 0日龄时显著下降 ,380日龄时回升至较高水平。公鸭血清中GnRH浓度的年龄性变化与母鸭相似 ,10 0日龄时最高 ,2 0 0日龄时最低