延黄牛ALDH1A1基因CDS序列克隆及其在各组织中的表达差异研究

为探索乙醛脱氢酶1A1(acetaldehyde dehydrogenase 1A1,ALDH1A1)基因功能,本试验以16月龄延黄牛母牛为研究对象,屠宰后采集心脏、肝脏、肺脏、肾脏、胃、十二指肠、皮下脂肪和背最长肌,提取总RNA。根据GenBank上公布的牛ALDH1A1基因mRNA序列(登录号:NM_174239.2),利用Oligo 7.0软件设计引物,应用RTPCR扩增ALDH1A1基因,将扩增产物连接pMD18-T载体进行克隆测序,获得延黄牛ALDH1A1基因完整CDS序列,应用生物信息学软件分析核苷酸序列及其蛋白结构。以延黄牛不同组织总RNA为模板,通过实时荧光定量PCR技术检测ALDH1A1基因在延黄牛各组织间的表达差异。结果显示,ALDH1A1基因CDS序列全长1 506bp,编码501个氨基酸;延黄牛ALDH1A1基因序列与野牛、牛的同源性最高(≥99.7%),与猫和豹的同源性分别为89.4%和89.6%,符合物种进化规律。ALDH1A1蛋白分子质量为54.805ku,理论等电点为7.16,亲水性较强,占86.4%,酸性氨基酸和碱性氨基酸分别占11.4%和12.2%,属于可溶性蛋白,但不是分泌性蛋白,无典型信号肽切割位点;存在31个氨基酸磷酸化位点(分值>0.5)。延黄牛ALDH1A1蛋白二级结构含有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲,分别占42.12%、16.17%、8.18%和33.53%,与该蛋白三级结构预测结果相同。实时荧光定量PCR结果表明,ALDH1A1基因在延黄牛肝脏、胃、皮下脂肪、十二指肠和肾脏组织中极显著表达(P<0.01);在背最长肌中显著表达(P<0.05)。本试验结果为进一步开展延黄牛ALDH1A1基因功能及肉质基因筛选研究提供了参考依据。     

大鲵α1-血红蛋白基因的生物信息学分析及组织表达研究

 从大鲵皮肤cDNA文库中分离获得大鲵α1 血红蛋白基因全长cDNA序列,生物信息学分析表明,大鲵α 血红蛋白基因全长cDNA序列为594 bp,开放阅读框共432 bp,编码144个氨基酸,编码的大鲵α1 血红蛋白推测的理论分子量为16048.3 u,等电点为6.44。氨基酸组成中酸性氨基酸11.9%,中性氨基酸69.9%,碱性氨基酸18.2%。结构分析表明,该蛋白没有信号肽,但在100~122个氨基酸处以及98~122个氨基酸处分别有由里向外、由外向里的跨膜螺旋区,二级结构以α 螺旋为主。氨基酸序进行同源性列比对表明与人、猕猴的亲缘关系最近,和牛蛙的亲缘关系最低只有35%。荧光定量PCR结果表明,α1 血红蛋白基因在肌肉中表达量最高,在胃中最低。     

链孢粘帚霉寄生核盘菌菌核差异表达基因的筛选及分析

为克隆和研究链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum寄生核盘菌菌核的相关基因,应用抑制消减杂交技术构建了cDNA消减文库并进行了筛选。通过PCR技术从文库中共筛选到1315个阳性克隆,克隆中插入片段大小主要集中于300～600bp之间。随机挑取120个克隆,经测序和同源性分析,获得60条有效序列,其中部分序列所编码的血红素加氧酶、核糖体蛋白L11、细胞色素P450及热激蛋白等均参与机体对胁迫条件的应答反应。11条序列在NCBI数据库中未找到显著匹配的序列,可能为新基因片段。分别将寄生于核盘菌菌核上的粘帚霉cDNA和粘帚霉与核盘菌纯培养的cDNA混合物经RasⅠ酶切后进行标记作为探针,利用反向Northern杂交技术验证了所选取的25条序列全部为差异表达基因片段。     

茶树GGPS基因家族的克隆、生物信息学和表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPS)是萜类合成途径的结构酶,对植物生长发育具有重要意义。本研究通过RACE和RT-PCR方法克隆得到5条潜在的茶树GGPS序列,分别命名为CsGGPS1-4和CsGGPS9,其中CsGGPS9存在3条等位基因,分别是CsGGPS9-1、CsGGPS9-2和CsGGPS9-3,在系统进化树上与其他基因分成两支。蛋白质序列分析表明,茶树GGPS家族成员都具有polyprenyl_synt结构域,不存在信号肽序列。亚细胞定位预测结果显示,CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4定位在叶绿体上,CsGGPS3和CsGGPS9定位在线粒体上。通过Swiss Model进行三维建模,结合"three-floor"模型对茶树GGPS家族成员的功能进行预测,预测结果显示,CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4是GGPS;CsGGPS3是异源二聚体形式的牻牛儿基焦磷酸合酶的小亚基;CsGGPS9的催化主产物是碳链数大于30的异戊烯基焦磷酸。q RT-PCR分析表明,CsGGPS1整体表达丰度较低,仅在一芽二叶中表达量稍高;CsGGPS2在茶树各个组织中均有表达,在花中表达量最高,且花发育过程中表达量先上升后下降;CsGGPS3在叶和幼根中的表达量高于花,花发育过程中表达平稳;CsGGPS4在茶树各个组织中表达量数值相近,在花发育过程中表达量变化趋势与CsGGPS2相同;CsGGPS9的表达量在成熟叶中显著低于幼嫩叶片。     

Structure and Expression In planta of Botrytis cinerea Ubiquitin Genes

To identify genes of the necrotrophic pathogenic fungus Botrytis cinerea that are expressed during infection of tomato leaves, a differential screening of a genomic library with radioactively labelled cDNA was performed. This resulted in the identification of a B. cinerea gene, denominated Bcubi4, which encodes a precursor protein consisting of four identical head-to-tail repeats of a 76aa ubiquitin unit. Subsequently a gene denominated Bcubi1CEP79, encoding a single ubiquitin unit joined to a Carboxyl Extension Protein of 79 amino acids, was isolated. The expression of the two ubiquitin genes was studied during pathogenesis of B. cinerea on tomato. Bcubi1CEP79, but not Bcubi4, mRNA was transiently induced at 16h after inoculation. The increased expression of the Bcubi1CEP79 gene at this stage of pathogenesis might be required for enhanced ribosomal biogenesis.     

DNA甲基化与肿瘤研究进展

对肿瘤研究的不断深入,发现除了基因突变之外,表观遗传改变也与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤表观遗传的改变以DNA的异常甲基化为主。DNA的异常甲基化几乎存在于任何类型的人类肿瘤中,包括皮肤恶性肿瘤。DNA甲基化是指在DNA甲基化酶的作用下,以S-腺苷酸-L-甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到特定碱基上的过程。基因的正常功能除了依赖于正常结构外,还依赖于正常的甲基化状态。DNA的异常甲基化在肿瘤发生中起重要作用。     

甘薯潜隐病毒莲藕分离物辅助成分-蛋白酶基因原核表达及抗血清制备

根据已报道的甘薯潜隐病毒莲藕分离物sweet potato latent virus-lotus(SPLV-lotus)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR从感病莲藕样品中扩增获得SPLV-lotus辅助成分-蛋白酶基因(HC-Pro),大小为1 375 bp。通过序列测定和分析后,将其克隆到原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导并纯化获得大小为74 kD的融合蛋白pGEX4T-1-HC-ProSPLV-lotus。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白获得过量表达。以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备抗血清,采用ELISA和Western blot对抗血清效价和特异性进行检测,当HC-Pro抗血清稀释比为1∶256 000时,ELISA显色后OD450读数仍高于0.6,表明所制备抗血清合格;Western blot结果显示,在感染SPLV-lotus植株样品中仍能检测到单一目的条带。这些结果表明,制备的抗血清效价合格且可用于SPLV-lotus的特异性检测。     

NA-1株鹅源副黏病毒表面结构蛋白HN的真核表达

应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出HN蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHN。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHN,回收目的基因HN片段并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAHN。用SacⅠ酶切pPICZαAHN使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63000的重组蛋白,且该重组蛋白可与NA-1株病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明NA-1的HN蛋白片段在Pichiapastoris中获得成功表达。     

人孕酮受体激素结合区基因表达产物的检测与制备

PuPR为含有编码人孕激素受体（hPR）激素结合区（LBD）基因（631-933氨基酸）的pUC19重建质拉,在其宿主Escherichiacoli（BL21）中,经1mmol/L的IPTG诱导,该转化的细菌产生一C端为6×His结尾的蛋白质,分子量45KD。该表达产物可利用Ni-NTAHRP在ng水平用Western印迹检测,并可通过亲和层析的方法,利用His－bindingresin（Ni树脂）从菌体的裂解液中方便地回收到该蛋白质。     

非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达

为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%～99.2%和97.9%～99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%～93.6%和96.4%～97.5%之间;在N基因系统发育进化树上,非典型CDV与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。N基因在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62 ku,主要以包涵体的形式存在;用western blot分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应;以纯化的重组N蛋白为抗原建立的CDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。