检测鸡肉中甲羟孕酮酶联免疫试剂盒的研制

试验旨在利用酶联免疫技术研制一种快速检测鸡肉中甲羟孕酮的试剂盒。经测试,该试剂盒对鸡肉样本的检测限为1 μg/kg,批内、批间相对标准偏差均小于10%;稳定性测试结果表明,试剂盒能在4℃保存12个月;交叉反应率结果表明,单克隆抗体特异性良好。该试剂盒的操作时间仅需45 min,适合现场大量样本的快速检测。     

基于粗糙集和神经网络在小麦病害诊断中的应用

针对小麦病害诊断过程的复杂性以及处理信息的不确定性,综合了粗糙集理论与BP神经网络的各自优势,构建了小麦病害诊断模型。首先是对连续的样本数据进行离散化,主要采用差别矩阵计算方法进行启发式知识约简,得到最小简化规则,然后把约简结果作为BP神经网络的输入结点。实验结果表明,采用该方法不仅优化了神经网络的拓扑结构,还降低了神经网络的训练时间,同时大大提高了学习速度和故障诊断的准确率。     

大型肉鸡养殖场中死淘鸡病原菌分析

本试验通过对山东某地区8个大型集约化肉鸡养殖场的27只死淘鸡进行剖检、电镜观察、病原菌分离鉴定,明确了细菌混合感染为其显著特征,此地区优势致病菌依次为粪肠球菌、浅绿气球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌。用专利产品(专利号:ZL 2009 2 0253251.5)吸管药敏检测盒对死淘鸡病变组织的细菌混合感染进行药敏检测,对照传统的药敏检测结果,表明吸管药敏检测盒具有准确的原位药敏检测的特点和优势,有助于了解肉鸡养殖场潜在的致病因素、提供可行的预防方案。     

犬瘟热诊断技术的研究进展

近年来,犬瘟热已严重危害了犬及毛皮动物养殖业的健康发展,快速、准确的诊断技术对于犬瘟热的预防显得尤为重要。现阶段犬瘟热诊断技术的研究主要有病毒分离培养与镜检观察、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化、免疫胶体金、核酸杂交、巢式RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、双重PCR、基因芯片、液相芯片、环介导等温扩增等。获得能产生典型细胞病变的易感细胞株是成功进行犬瘟热病毒分离培养与镜检观察的关键。作者就犬瘟热诊断技术的研究进展作一综述,为有效预防和控制犬瘟热的流行和暴发提供简便、高效的检测技术。     

氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星（FLE）人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法（UV Scan）和聚丙烯凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6-7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30 μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫,免疫间隔3周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、优化FLE的icELISA检测方法,确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件,制备出FLE快速检测试剂盒,同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标,并与高效液相色谱法做相关性比较,同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定,以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定,结果显示BSA与FLE偶联后,FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA,初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104,抑制价为162.18 ng•mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法,其工作条件：包被浓度：5 μg•mL-1;抗体工作浓度：1﹕6400;二抗稀释度：1﹕1000;底物显色时间：10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng•mL-1,标准曲线回归方程为y=－0.3627x + 1.3517（R2 = 0.9956）,与同系药物及其它药物均无明显交叉反应,阳性猪肝样的回收率在67.5%-87.9%,平均78.7%,变异系数在9.34%-10.7%,平均10.0%;阳性猪肉样的回收率在74.0%-88.2%,平均81.42%,变异系数在8.3%-10.4%,平均9.48%;平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng•mL-1 5个标准浓度 B/B0的批内变异系数在3.39%-6.68% ,批间变异系数在4.69%-9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%-110%),进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原,利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法,制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。     

Tissue‐print and squash real‐time PCR for direct detection of ‘Candidatus Liberibacter’ species in citrus plants and psyllid vectors

Huanglongbing (HLB) disease is seriously threatening and/or damaging the citrus industry worldwide. Accurate detection of the three species associated with HLB disease, ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, ‘Candidatus Liberibacter africanus’ and ‘Candidatus Liberibacter americanus’, is essential for the preventive control of the disease. Real‐time PCR is a useful tool for bacterial detection. However, nucleic acid purification steps limit the number of samples that can be processed by PCR. Universal detection of ‘Ca. Liberibacter’ species was achieved by direct tissue‐printing and spotting of plant leaf petiole extracts or squashing of individual psyllids onto paper or nylon membranes. Primers were designed and used with TaqMan chemistry for accurate detection of the bacterium in immobilized targets (prints of 10 overlapping leaf pedicels per tree, or squashed single vectors), by extraction with water and direct use for real‐time PCR. This simplified method was validated and could detect HLB‐liberibacters in 100% of leaves with symptoms and 59% of symptomless leaves collected from HLB‐infected trees. The use of direct assays as template showed good agreement with use of purified DNA (κ = 0·76 ± 0·052). The squash assay allowed detection of the bacterium in 40% of mature Diaphorina citri that fed on leaves of HLB‐infected trees with or without symptoms. A commercial ready‐made kit based on this technology showed 96% accuracy in intra‐laboratory performance studies. The simplified direct methods of sample preparation presented herein can be effectively adopted for use in rapid screening of HLB agents in extensive surveys, certification schemes or for epidemiological and research studies.     

稻纵卷叶螟危害后水稻叶片的光谱特征

【目的】阐明水稻受稻纵卷叶螟危害后不同受害程度的叶片、卷叶的分布形式及卷叶率对稻叶光谱特征的影响,获取诊断水稻受害程度的模型,以便为稻纵卷叶螟的遥感监测提供理论指标与方法。【方法】试验以不同受害等级的虫害叶及健康叶为材料,在室内恒定条件下采用ASD光谱仪分别测定不同受害程度、受害叶片的不同分布形式、及不同卷叶率下稻叶的光谱反射率,并采用直线回归法,建立基于光谱参数的水稻受害程度诊断模型。【结果】水稻虫害叶光谱反射率均随受害等级的增加,在绿光区(530—570nm)和近红外区(700—1050nm)降低,而在红光区(610—700nm)增加。能反演叶片受害程度的敏感波段为530—564nm、614—695nm和706—1050nm。建立了5个反演叶片受害程度的模型,诊断准确率在80%—90%之间,并且以741nm处的反射率对叶片受害程度的诊断效果最好。在卷叶率恒定的条件下,卷叶的分布位置对光谱反射率影响较小;而卷叶率对光谱反射率的影响较大,表现为随卷叶率的增大,450—500nm和610—700nm处的反射率增大,530—570nm和700—1050nm处反射率降低。差值植被指数(Rnir-Rred)、黄边面积(SDy)及红边面积与蓝边面积的差值(SDr-SDb)等指标均能将6个不同等级的卷叶率(0、10%、30%、50%、70%和90%)区分开,并且利用黄边面积(SDy)指标诊断卷叶率的准确率达86%。【结论】水稻受稻纵卷叶螟为害后,在叶片光谱反射率上有明显的表现,可以利用光谱特征来监测稻叶的受害程度及卷叶率大小。     

重组N蛋白抗原检测PPRV抗体ELISA的研究——试剂盒阴阳性临界值的测定及其与OIE参考实验室试剂盒的比较

对临床上采集的244份不同背景的羊血清样本,用纯化的重组N蛋白为包被抗原建立的检测小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的间接ELISA进行检测,运用统计学方法摸清了检测结果的分布规律,并同时用OIE参考实验室抗体检测试剂盒进行检测,结果表明,两种检测方法的符合率为91.73%。利用TG-ROC软件分析了ELISA抗体检测临界值,该试剂盒与国外试剂盒相比,其相对特异性和敏感性分别为98.6%和85.4%。     

动物源大肠杆菌及沙门氏菌抗药性的快速检测

利用本室自主研制的新型96点阵药敏检测盒检测山东地区动物源大肠杆菌、沙门氏菌的药物敏感性,试验结果表明,大肠杆菌对氨苄西林和喹诺酮类药物的抗药率达98%以上,禽源大肠杆菌的抗药率高于猪源大肠杆菌,猪源大肠杆菌的抗药谱广于禽源大肠杆菌;沙门氏菌抗药率略低于大肠杆菌,但同样呈现多重抗药,主要集中在5抗-7抗和13抗-14抗两个范围。96点阵抗生素药敏检测盒是适合于试验室进行大规模抗药性监测的新工具,具有简易、准确、快速、大通量、节约的优点,为临床治疗中抗生素的使用、细菌病的治疗提供了技术保障,从而达到避免盲目使用抗生素,降低细菌抗药率的目的。     

两种免疫酶试剂盒检测猪抗E型肝炎病毒IgG的比较

目的比较两种免疫酶试剂盒recomWell HEV IgG(swine)ELISA(recom Well )和recomLine HEV IgG(swine)(recom Line )检测猪抗E型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)IgG的准确性。方法分别采用基因3型和基因4型人HEV(human HEV,hHEV)人工感染无菌猪各2头,采用上述试剂盒检测猪感染后不同天数的血清样品中抗HEV IgG,同时对两头接种PBS液的无菌猪血清样品18份和4头未感染猪的18份血清进行了检测。结果 2头猪人工感染基因3型hHEV后,recomWell检测均于感染后21d出现阳性,并持续56d;recomLine检测,其中1头猪于感染后14d呈阳性,而另1头于感染后21d呈阳性,且均持续56d。2头猪人工感染基因4型hHEV后,两种试剂盒检测,其中1头猪于感染后21d呈阳性,另1头35d呈阳性,并均持续56d仍为阳性。18份对照血清两种试剂盒检测均为阴性。18份未人工感染猪血清中,只有1份两种试剂盒检测均为阳性。两种试剂盒同时检测的共72份样品中,recomWell检出阳性样品23份,阳性率约为32.0%(23/72),recomLine检出阳性样品24份,阳性率约为33.30%(24/72),检出阳性率两者差异不显著(P>0.05);在recomWell检出的23份阳性样品中,recomLine检测均为阳性,两者阳性检出符合率为100%(23/23);recomWell的漏检率约为4.1%(1/24)。结论 recomWellR和recomLine均可用于猪抗HEVIgG的检测,recomLine检测灵敏度略高于recomWell,且操作更简便,不需要特殊昂贵的检测设备,特别适合用于基层检测猪抗HEV IgG。