禽偏肺病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中已经发表的B亚型禽偏肺病毒（aMPV）F基因的保守序列设计并合成1对引物,利用RT—PCR可以扩增出1条725bp的片段,进行特异性试验和敏感性试验,建立了禽偏肺病毒病的RT—PCR检测方法。特异性试验表明,建立的RT—PCR检测方法能够从禽偏肺病毒疫苗毒株VIR115-B中扩增到725bp的特异性片段,而对H9N2亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的扩增结果均为阴性;敏感性试验表明,该方法最低检出量的cDNA质量浓度为1．45μg／L;对山东省492份病料进行检测,阳性检出率为43．09％（212／492）,随机挑取11份进行克隆测序及序列分析,结果显示所扩增到的阳性产物均为B亚型的禽偏肺病毒。建立的禽偏肺病毒的RT—PCR检测方法具有快速、准确、特异性强、敏感性高的特点。     

NASBA技术及其在畜禽病毒检测中的应用

NASBA即核酸序列依赖扩增技术,主要用于扩增RNA,是由一对特异性的引物介导的、连续均一的、体外核酸序列等温扩增反应过程.该技术具有操作简便,特异性强,敏感性高,快速,高通量等优点,目前已经广泛应用于人类与动物的多种病毒性疾病的检测,具有良好的应用前景.在禽流感病毒、新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒等的检测...     

含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的烈性传染病,为了保证其检测结果的准确性和可靠性,需要研制试剂盒中使用的阳性标准质控品。本试验旨在研制含ASFV核酸序列的病毒样颗粒,并探究其在检测方法中的应用。首先扩增p72基因的全长片段,利用昆虫杆状病毒系统,包装出含有p72基因的ASF DNA病毒样颗粒。为了进一步验证该病毒样颗粒在应用中的可靠性,本研究将病毒样颗粒与ASF的组织毒及细胞毒同时进行DNA核酸提取,进行实时荧光定量PCR。结果表明,本研究制备的病毒样粒子能很好的取代ASFV在实时荧光定量PCR检测方法中作为阳性质控品,且能对核酸提取过程进行质控,实时荧光定量PCR检测试剂盒中,病毒样粒子的最低包装浓度为10² TCID₅₀。进一步研究发现该病毒样颗粒也适用于普通PCR及LAMP检测方法中,最低浓度分别为10³和10¹ TCID₅₀。本试验结果将为规范ASF检测方法,促进ASF检测方法的转化应用及保证检测结果的准确度和可靠性提供科学依据。     

麻雀自然感染鸡传染性法氏囊病病毒的调查

从鸡传染性法氏囊病（IBD）流行的鸡场捕杀麻雀54只,用鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）单克隆抗体夹心阻断ELISA检测抗体,阳性检出率为7.4％(4/54);以逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测病毒核酸,阳性检出率为11.1％（6/54）;RT-PCR阳性样本病毒分离亦为阳性。结果表明,IBD流行的鸡场里的麻雀能够发生IBDV自然感染,麻雀可能是IBDV的贮存宿主或二次传染源之一。     

间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清4型鸭疫里默氏杆菌抗体的研究

应用超声波裂解珐制备的血清4型鸭疫里默氏杆菌(RA)裂解物作为抗原包被酶标板，成功建立了4型RA抗体检测的间接ELISA法。     

EMA与PCR结合检测沙门氏菌方法的研究

为了建立一种快速区分样品中沙门氏菌的死细菌与活细菌的检测方法,将叠氮溴化乙锭（EMA）与PCR技术相结合。以沙门氏茵的invA为靶基因,以沙门氏菌的纯培养细胞做模板进行扩增,并进行灵敏度、特异性、曝光时间及EMA浓度试验。结果显示,灵敏度为14CFU／mL,最佳曝光时间为2min,当EMA的浓度小于18μg／mL时．EMA对活菌靶基因的扩增没有明显的抑制,而终浓度为1μg／mL的EMA,能有效抑制lxlosCFU／mL沙门氏菌死菌的扩增。EMA—PCR能有效降低沙门氏菌检测过程中的假阳性。     

玉林市犬狂犬病流行状况调查

通过调查问卷方式得知2010-2016年玉林市犬只饲养量年均20.13万头,免疫犬年均为13.64万头,免疫密度年均为67.74%,仍存在未经免疫的犬。ELISA方法检测免疫犬抗体阳性率为91.57%(1509/1648),非免疫犬为4.13%(10/242);RT-PCR方法检测520份犬脑组织,病原检出率为5.00%(26/520)。通过数据分析与实际情况结合,表明玉林市犬狂犬病免疫抗体合格率较高,疫苗效果表现稳定,外观健康犬仍携带狂犬病病毒。     

鸡新城疫病毒B_(95)株的RT-PCR检测方法研究

本试验设计了一对B95 株的特异引物NDV -P1/P2,探讨了对其进行RT-PCR检测的可行性。结果证明 ,用该引物可以扩增出一条310bp的特异核酸带 ,敏感性为0.0043ng/ul。     

PRRSVNsp9蛋白基因的RT—LAMP检测方法的建立

根据GenBank中登录的PRRSVNsp9基因序列,应用PrimerExplorerV4软件,在该基因序列中选取保守区设计了4条RT—LAMP引物,旨在建立1种针对Nsp9蛋白基因的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）的快速检测方法。采用引物分组扩增的方法对引物进行了检测,以确保引物的可靠性。对反应体系、温度以及时间进行了优化,检测了该方法的特异性和灵敏度。结果表明,该方法在等温条件下只需50min就能检测出结果。与RT-PCR方法相比,在判定检测结果时不需要借助昂贵仪器设备,具有高特异性、高灵敏度、操作简便快速等特点,适合于临床检测的应用。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株的核苷酸序列与古典美洲株的核苷酸序列,设计一对高致病性PRRSV特异性引物,结合快速的RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立高致病性PRRSV快速RT-PCR检测体系。通过测序和同类试剂盒检测效果比对,证实该体系检测结果准确,体系特异性和灵敏度试验结果显示,该体系对猪瘟病毒、普通PRRSV、禽流感病毒无扩增产物,至少能检测经10万倍稀释后的临床阳性样品。该方法可直接对可疑组织样品进行检测,操作简单、快速、价廉、受环境因素污染概率小,适合临床样品的检测。