锌指核酸酶及其应用研究进展

锌指核酸酶由锌指和非限制性切割酶两部分组成,锌指能特异性结合基因组双链DNA,非限制性切割酶能造成染色体上双链DNA的断裂,通过机体的修复机制可以使目的基因突变或外源基因插入,进而应用于转基因动物的制备.综述了锌指、切割酶及采用锌指核酸酶制备转基因动物的研究进展,主要包括锌指的发现、结构及与DNA结合时的碱基分布和结合方式,锌指的筛选和设计方法;切割酶的研究进展包括FokⅠ的发现及切割特点,基因修饰后的异源二聚体切割特异性等.     

H4亚型家养水禽流感病毒分离株的表面膜蛋白基因的序列测定和遗传进化分析

采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行4年多的监测，分离鉴定出多株H4亚型禽流感病毒。对其中的A／Duck／Yangzhou／216／2002（简称Dk／YZ／216／02）、A／Duck／Yangzhou／526／2003（简称Dk／YZ／526／03）、A／Duck／Yangzhou／36／2004（简称Dk／YZ／36／04）的血凝素基因和Dk／YZ／526／03、Dk／YZ／36／04的神经氨酸酶基因进行了克隆测序，并与GenBank中收录的其它序列进行了比较，遗传进化结果表明Dk／YZ／216／02的血凝素基因（HA）与毒株Tk／Minnesota／833／80（H4N2）同源性最高，而Dk／YZ／526／03和Dk／YZ／36／04的血凝素基因（HA）均与Budgerigar／Hokkaido／1／77（H4N6）同源性最高；而神经氨酸酶基因（NA）遗传进化分析结果表明Dk／YZ／36／04（H4N6）的NA基因与毒株Pigeon／Nanchang／8-142／2000（H3N6）同源性最高，而Dk／YZ／526／03（H4N2）的NA基因与Dk／Hokkaido／13／00（H9N2）同源性最高，3株禽流感病毒的HA推导的氨基酸剪切位点序列均为P-E-K-A-S-R，为典型低致病性禽流感病毒的特征序列，与对SPF鸡的致病力试验相吻合。     

牛肠激酶次特异性识别序列分析

在酶切融合蛋白时 ,除正常切割和非特异性切割以外 ,发现了牛肠激酶的一个可能的次特异性识别序列。分析了其产生的原因以及在基因工程研究中的意义。     

冻融循环条件下SBS改性沥青混合料的水稳定性研究

在我国北方寒冷地区,冬、春季更替时沥青路面材料长时间处于含水、低温冰冻状态及温度交替变化过程中,因水分和温度的共同作用引起的冻融循环而导致路面开裂现象较为普遍.本文对SBS改性沥青混合料试件进行多次冻融循环后进行劈裂试验,利用空隙率和冻融劈裂抗拉强度随冻融循环次数增加的变化规律来评价SBS沥青混合料的水稳定性.研究结果表明:SBS改性沥青混合料的强度及水稳定性受多次反复冻融影响衰减显著.     

绵羊精液不同处理方法对体外受精效果的影响

试验通过开展绵羊低温保存精液和冷冻精液制备精子对体外受精效果影响的研究,旨在探讨制备绵羊IVF优质精液的新方法。结果表明:利用低温保存精液和冷冻精液,分别采用Percoll离心法和上游法制备精子进行体外受精,低温保存精液上游法的卵裂率78.6%显著高于低温保存精液和冷冻精液Percoll离心法和60.2%、62.3%,(P<0.05),极显著高于冷冻精液上游法21.1%,P<0.01;低温保存精液和冷冻精液Percoll离心法组间无显著(P>0.05)差异,但均显著(P<0.05)高于冷冻精液上游法。低温保存绵羊精液可用于制备IVF精子,上游法优于Percoll离心法,可显著提高体外受精效果。     

雪龙黑牛试管胚胎产业化生产培养方法的建立

为充分利用雪龙兼松屠宰场废弃的优秀母牛卵巢,加速雪龙黑牛培育进程,满足高档牛肉市场需求,本文对胚胎生产体外受精3个关键技术环节进行了试验研究,共做了15批次试验,包括卵母细胞体外成熟培养的试验研究,卵母细胞体外受精试验研究以及受精卵体外培养试验研究。结果显示,卵母细胞的成熟率达98.6%,卵裂率为86.5%,囊胚发育率为36.8%。初步建立了一整套雪龙黑牛试管胚胎产业化生产培养方法和技术。     

生长激素和胰岛素对猪卵母细胞体外成熟及卵裂的影响

研究了生长激素(STH)、胰岛素(insulin)单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂的影响。结果表明:STH、胰岛素对卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂呈现双重效应。在mNCSU-23基础液中添加0.15μg/mLSTH组的成熟率和卵裂率显著高于对照组及0.01,0.05,0.1,2μg/mL组(P<0.05);添加5μg/mL,8μg/mL胰岛素组的成熟率显著高于对照组及0.5,2,10μg/mL组;添加5μg/mL胰岛素组的卵裂率也显著高于对照组及0.5,2,8,10μg/mL组;0.15μg/mLSTH与2μg/mL胰岛素联合添加组的成熟率和卵裂率最高,同其他组相比,差异显著。     

缢蛏受精和早期卵裂过程的细胞学变化观察

采用普通光镜、荧光显微镜和石蜡切片技术,对缢蛏受精和早期卵裂过程中的精子入卵、减数分裂、雌雄原核形成与结合、早期卵裂以及多精入卵等细胞学事件进行了显微观察。结果表明,缢蛏成熟未受精卵多呈圆球形或卵圆形,少数呈梨形,卵径为82～88μm,核相处于第一次成熟分裂中期;精子为典型的原生型,全长55～58μm,头部呈保龄球形,顶体前端的顶体杆呈特别细长的花丝状;在水温21～22℃、盐度10的条件下进行人工授精,精、卵混合后,精子迅速附着于卵子表面,启动卵子发育;受精后4～6 min,精子的头部已进入卵内并明显膨胀,卵子外形变圆,卵外附着的精子量明显减少;在受精后12～15 min、20～25 min,受精卵先后排出第一极体、第二极体,完成两次成熟分裂;第二次成熟分裂结束以后,精、卵核体积迅速膨胀,雄原核的膨胀早于雌原核,核膜重建,在受精后约30 min形成雌、雄原核;雌、雄原核均向卵子中央移动,雄原核旁边的精子星光清晰可见,随后二者在卵子中央以染色体联合的方式结合,联合核的染色体共同排列在纺锤体的赤道板上,形成第一次有丝分裂的中期分裂相;受精后40 min左右,受精卵进行第一次卵裂,染色体在纺锤丝的牵引下向两极移动,结果形成2个大小不等的卵裂球;受精后45～50 min,卵子进行第二次卵裂,核相变化与第一次卵裂相同,在与第一次卵裂垂直的纵轴方向上发生不等全裂,最终形成3小1大4个卵裂球;受精后60～70 min,胚胎进行第三次卵裂,仍为不等全裂,但自此次卵裂起已开始进行螺旋分裂。此外,对实验中发现的缢蛏极少量多精入卵、多极分离等异常细胞学现象进行了分析,并探讨了海洋贝类卵子阻止多精入卵发生的机制。     

虹鳟受精卵第一次卵裂组织学观察及四倍体制备最佳时机的研究

采用组织切片技术对虹鳟受精卵第一次卵裂进行观察,且利用热休克和静水压处理受精卵,诱导四倍体。其结果显示,静水压诱导效果较好,在受精后8h进行诱导四倍体的出现率最高,达到25～28%。热休克诱导未出现四倍体。受精卵在受精后400min(积温43.5℃.h)处于第一次卵裂前期,受精后490min(积温52.5℃.h)处于第一次卵裂中期,受精后640min(积温66.8℃.h),处于第一次卵裂后期,670min(积温69.3℃.h)处于第一次卵裂末期,700min(积温71.8℃.h)以后形成卵裂沟,并穿过整个受精卵,产生两个均等大小的两个卵裂球(blastomeres)。     

Cumulus Expansion, in vitro Fertilization and Embryonic Development after in vitro Maturation of Bovine Oocytes in the Presence of Follicle Stimulating or Luteinizing Hormone

Contents: Bovine follicular oocytes were matured and fertilize din vitro. The frequency of penetration and subsequent embryonic development were improved considerably, for oocytes cultured in larger volumes allowing larger oocyte groups as compared to the culture of 2 oocytes within 30 μl drops. The effects of follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), present during in vitro maturation, were studied in terms of cumulus expansion, oocyte penetration, male pronucleus formation and embryonic development. Cumulus expansion including mucification was induced by both hormones. Scanning electron microgfaphs revealed that storage of LH as a frozen solution over a long time period (10 months), destroyed its ability to stimulate cumulus mucification, whereas uncoupling of the cumulus cell processes still occurred. LH caused an increase in the percentage of penetrated oocytes with incomplete sperm head decondensation. This effect was also lost after long term storage. Teh resulting total penetration frequency as well as the proportion of oocytes with both pronuclei formed was now similar to that observed with oocytes matured with fresh LH or FSH. Embryonic development was not altered by the replacement of FSH by LH during in vitro maturation .