低温诱导甜菜(Beta vulgaris L.)Ty7Br600基因的Northern blotting和Southern blotting分析

以低温诱导甜菜幼苗为试验材料,以未进行低温诱导的甜菜幼苗为对照,采用α-32P-ATP放射标记按随机引物标记法标记本实验室克隆的Ty7Br600基因,进行Northern杂交。Northern杂交试验结果显示,在低温诱导培养的甜菜幼苗的RNA群体中,出现较强的杂交条带,而在未诱导培养的甜菜幼苗的RNA群体中,则几乎没有阳性杂交条带出现。因此,Ty7Br600这一序列有可能是二年生甜菜幼苗经低温诱导处理之后被诱导表达的与抽薹相关的新基因序列。Southern杂交结果发现,在每一组酶切中至少有2~3条条带,表明Ty7Br600确为甜菜基因组片段,也同时表明该基因在甜菜基因组中以2个拷贝或低拷贝形式存在。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1株OmpA基因表达与抗原性鉴定

为了研究禽多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白A(Omp A)的免疫原性,根据C48-1菌株Omp A基因序列设计一对特异性引物,采用PCR方法扩增去信号肽的成熟Omp A基因.将去信号肽的成熟Omp A基因扩增片段双酶切后,克隆到p GEX-6p-1表达载体中,构建重组表达质粒p GEX-Omp A,转化宿主菌BL21并经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-PAGE的结果显示,融合蛋白GST-Omp A大小约为63 ku,与预期的分子质量相符.免疫印迹分析结果表明,该融合蛋白与鸡抗Pm血清具有明显的免疫反应,说明Omp A具有良好的抗原性,这为禽Pm Omp A在免疫防御研究中的应用奠定了基础.     

甘草总黄酮对高脂条件下罗非鱼肝损伤的保护作用

为了研究甘草总黄酮对高脂饲料造成的罗非鱼(Oreochromis niloticus)脂肪肝损伤是否具有保护作用,随机将180尾健康无伤罗非鱼分成6组,即对照组、高脂饲料模型组和4个不同浓度甘草总黄酮组(0.05、0.10、0.50、1.00 g·kg^-1甘草总黄酮),每组30尾。饲喂90 d后,采集罗非鱼各实验组肝,测定肝匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)活性、丙二醛(MDA)含量、甘油三酯(TG)含量、总胆固醇(TC)含量、总抗氧化能力(T-AOC)水平,Western blotting法检测肝中核转录因子-κB P65(NF-κB P65)和核转录因子-κB C-Rel (NF-κB C-Rel)蛋白表达水平,RT-PCR法测定肝中微粒体甘油三酸酯转移蛋白(MTTP)和载脂蛋白B100(ApoB100)基因表达情况。结果表明:与对照组相比,高脂饲料模型组罗非鱼肝匀浆中TG、TC、MDA含量极显著(P<0.01)升高,GSH活性、SOD活性、T-AOC水平均极显著(P<0.01)降低;MTTP和ApoB100 mRNA表达水平降低(P<0.01或P<0.05);Western blotting结果显示,NF-κB P 65和C-Rel蛋白表达水平升高。饲料中加入甘草总黄酮后,与高脂饲料模型组相比,罗非鱼肝中GSH活性、SOD活性、T-AOC水平不同程度提高,TC、TG、MDA含量和NF-κB P65、C-Rel蛋白表达水平不同程度降低,MTTP和ApoB100的mRNA表达水平升高,以0.50 g·kg^-1甘草总黄酮组效果较好。说明甘草总黄酮对于罗非鱼脂肪肝损伤具有一定的保护作用,可以缓解高脂饲料造成的脂肪肝损伤。     

鳖源嗜水气单胞菌M-96株表面抗原分析

用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹技术分析嗜水气单胞菌Ｍ－９６株表面抗原,表明该菌体表面抗原是由分子量为３０ＫＤ、３３ＫＤ、３６Ｋ和３９ＫＤ的蛋白质和脂多糖组成,其中部分对胃蛋白酶敏感。     

牙鲆血清免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析

运用Sephacryl S-200凝胶层析和HiTrap rProtein ASepharose亲和层析2种方法对牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清免疫球蛋白进行分离纯化,结果表明,牙鲆免疫球蛋白分布于33%~50%的硫酸铵饱和溶液中,其中45%的分离效果最好。凝胶层析和亲和层析样品均出现2个蛋白峰,用还原SDS-PAGE检测确定牙鲆免疫球蛋白存在于第2个蛋白峰中。牙鲆免疫球蛋白重链分子量约为75.4 kD,轻链分子量约为29.9 kD和28.2 kD,推测牙鲆血清免疫球蛋白的分子量为836 kD。制备了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体,免疫双扩散法检测多克隆抗体效价为1∶32,免疫斑点法检测多克隆抗体效价至少为1∶1 600。运用免疫印迹法(Western-bloting)检测了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体的特异性,实验证明该抗体与牙鲆全血清中免疫球蛋白重链、轻链反应均成阳性。     

山羊TNNT3基因可变剪切及其对骨骼肌细胞分化的作用

【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T（fast skeletal troponin T3,TNNT3）作为肌钙蛋白(troponin, Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量（real-time PCR,RT-qPCR）及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织（背最长肌（longissimus dorsi muscle,LD）、半膜肌（semimembranosus muscle,SM）、心、肝、脾、肺、肾）和7个发育阶段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,MuSCs）中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3（NM_001314210.1）CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因 5个新转录本（TNNT3_1—5）,其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P < 0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌（P<0.05）;出生后则背最长肌中高于半膜肌（P<0.05）。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11（138bp）,体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符（37 kD）;相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因Myomaker、MyoG和MyH4 mRNA极显著升高(P < 0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。     

线粒体nad 6基因在油菜种子发育中的特异性表达

以油菜为材料，研究线粒体ｎａｄ６基因在种子发育中的表达。结果表明，ｎａｄ６基因在叶片中的表达很低，在种子发育过程中各阶段均有较高表达，并随种子发育进程而有加强的趋势。推测线粒体ｎａｄ６基因可能除与呼吸作用有关外还有其他功能     

核糖体蛋白S5(RPS5)基因对羊驼毛色调控的研究

本研究利用southern blotting技术从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出核糖体蛋白S5(Ribosomal proteinS5,RPS5)基因,测序后利用生物信息学方法对该基因进行了相关分析。经分析发现羊驼RPS5基因序列中存在CCGG位点,推测羊驼RPS5基因在此位点发生甲基化。RPS5基因通过调节处于不同凋亡方式的黑色素细胞,保证黑色素数量的产生,从而对羊驼毛色产生调控作用。     

Expression of recombinant triangular bream (Megalobrama terminalis) pre-IGF-I in Escherichia coli

The insulin-like growth factor I (IGF-I) cDNA (GenBank Accession No. AY247412) of triangular bream (Megalobrama terminalis) was expressed for the first time in Escherichia coli. To construct the expression plasmid, the IGF-I cDNA was subcloned into prokaryotic-expressing vector pGEX-4T-1. The E.coli JM109 was transformed with the recombinant plasmid pGEX-4T-1-IGF-I, and the transgene expression was observed after being induced with isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG). The results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting indicated that the recombinant fusion protein had immune activity and the molecular weight was about 47 kDa. The results of SDS-PAGE and thin layer scanning showed that the yield of fusion protein had been enlarged with prolonging time. When the time of induced expression was 1, 2, 3, 4, 5, and 6 h, the expression amount was approximately 1.4, 4.3, 8.1, 11.3, 16.3 and 18.8% of total bacterial protein respectively.     

羊驼核糖体蛋白S5(RPS5)全长基因的筛选及其序列分析

本研究利用southernblotting技术从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出核糖体蛋白S5(RibosomalproteinS5,RPS5)基因,测序结果表明该片断大小为436bp,含有一个完整的ORF。并利用生物信息学方法对该基因进行了分析,发现该基因编码的氨基酸在第1到88位之间含有一个典型的CARD结构域,即六个反平行的螺旋结构形成的结构域,该结构域对RPS5基因功能的体现起决定作用。