表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组马立克氏病病毒的构建

采用聚合酶链反应或反转录聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和PMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA.rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA.     

禽胰多肽粗品对肉鸡生长及血液生长激素、甲状腺激素水平的影响

1日龄粤黄鸡128只 ,随机分为4组 ,在饲喂相同日粮的条件下 ,Ⅰ组饲饮自来水为对照组 ,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组饲饮禽胰多肽(APP)粗品溶液 ,剂量分别为0.58、1.16和2.32mg/只 d。试验期84d。结果表明 :(1)84日龄时 ,各试验组鸡只平均体重均高于对照组 ,其中Ⅱ组显著高于对照组(P<0.05);(2)70日龄时 ,各试验组血浆GH水平均显著高于对照组(P<0.05) ;(3)56日龄时 ,Ⅱ组血浆T4 浓度、Ⅲ组T3 浓度均显著高于对照组(P<0.05)。提示APP粗品可促进肉鸡生长 ,提高血液中GH、T4 和T3 的含量。     

鸡多种肿瘤病快速鉴别诊断的研究初报

本文报告了鸡三种常见肿瘤病即马立克氏病 ( MD) ,淋巴白血病 ( LL)和网状内皮增生症( RE)快速鉴别诊断的研究。目前 ,本研究已初步确定了快速鉴定诊断办法的基本程序及 PCR反应条件 ,并且检测了从南宁、桂林等地 1 2个鸡场收集的肿瘤 /可疑肿瘤组织 59份 ,其中 MD阳性率为 91 .53%( 54/59) ,RE为 1 8.64% ( 1 1 /59) ,LL为 1 .69% ( 1 /59)。本研究首次证实 RE和 LL在广西的存在 ;结果还表明 ,该 PCR系统是敏感、特异和快速的。     

ALV-J相关的鸡急性纤维肉瘤发病模型的建立

【目的】证明纤维肉瘤病料中含有的ALV-J相关病毒能够诱发急性纤维肉瘤。【方法】将含ALV-J相关病毒的病料过滤液经不同部位接种1日龄817肉杂鸡;将该过滤液不同倍数稀释后接种1日龄SPF鸡和817肉杂鸡;将该过滤液接种细胞培养后的上清液接种1日龄817肉杂鸡,连续动态观测30 d。【结果】颈部皮下、胸肌、腹腔3个部位攻毒鸡的肿瘤发生率分别为100%（20/20）、95.2%（20/21）、100%（20/20）。病料过滤液未经稀释接种817肉杂鸡和SPF鸡的肿瘤发生率均为100%（10/10）,10倍稀释后攻毒鸡的肿瘤发生率分别为80%（8/10）和100%（10/10）,100倍稀释后攻毒鸡的肿瘤发生率分别为100%（10/10）和80%（8/10）,1 000倍稀释后攻毒鸡的肿瘤发生率分别为40%（4/10）和50%（5/10）,更高倍数稀释后攻毒鸡没有肿瘤发生。接种病料的细胞培养上清也能使33.3%（2/6）的鸡只发生肉瘤。病理组织学检测显示：诱发的急性肿瘤系典型的纤维肉瘤。【结论】817肉杂鸡肉瘤病料中含有ALV-J相关的急性致肿瘤病毒,不论是病料过滤液本身还是其接种DF-1细胞培养后的上清液都能在不同品种鸡复制出急性纤维肉瘤,最快在接种后7 d出现,且肿瘤发生的时间、动态和肿瘤发生率与接种量密切相关。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及在E.coli中的表达

选择一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(简写为GD/1/96),根据测得的NS基因序列,设计一对特异性引物NS1U/NS1L,RT-PCR方法扩增该毒株的NS1基因。将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体PET-32a( ),并进一步酶切分析和序列测定,鉴定出NS1基因的阳性重组子。阳性质粒转化E.coliBL 21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定,成功的在细菌包涵体中表达出45 kD的NS1融合蛋白。重组蛋白经Ni-NTA His.Bind Resins纯化。     

禽白血病病毒多重PCR检测法的建立及初步应用

根据GenBank中登录的禽白血病病毒A、B、J亚群的核苷酸序列设计合成了3对引物,各对引物可分别扩增出大小约为195、260、924bp的核苷酸片段;经优化建立禽白血病病毒多重PCR检测法,并进行其敏感性试验及对马立克病病毒(MDV)、火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和DF-1细胞基因组的特异性试验;应用该方法对1 294份临床样品进行禽白血病病毒检测,对阳性检出样品抽样进行测序鉴定.结果表明:该方法的最小检出拷贝数为103,特异性试验均为阴性,检出临床样品中的核苷酸片段与参考毒株核苷酸序列的同源性达98%以上,符合率100%,具有良好的特异性、敏感性和符合率,可为禽白血病病毒感染的临床诊断及流行病学调查研究提供有效借鉴.     

禽流感油乳佐剂疫苗质量快速检测方法的建立

通过对低温冻融法、研磨法、稀释高速捣碎法、95%乙醇法及三氯甲烷法破乳效果比较,确定三氯甲烷为油乳剂疫苗的破乳剂.将不同抗原含量的H9和H5亚型灭活与非灭活疫苗破乳后分离上层水相,采用红细胞凝集(HA)试验,测定其HA价,结果发现脱乳后上层水相与未做成油乳疫苗并做相应稀释的原液的HA价下降1～3个滴度,且将不同稀释度制备H5亚型疫苗经脱乳处理后上层水相的HA价与荧光定量PCR结果基本一致.所建立的禽流感油乳剂疫苗质量的检测方法具有快速、经济、简便,尤其适合于对大批量及基层应用.     

髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒四川株SCGS-1的分离鉴定及前病毒cDNA重组质粒的构建

为分析髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒(ALV-J)地方分离毒株的分子特征及开展该病毒的反向遗传操作研究,本试验从四川某肉种鸡场髓细胞瘤病变病鸡的组织中分离到1株髓细胞瘤型ALV-J,命名为SCGS-1.序列测定表明其前病毒cDNA全序列长7 499 bp,与其他ALV-J代表毒株序列相似性均为95％～99％.在所有基因中,其env基因和LTR序列与其他毒株相应序列同源性相对较低,env基因同源性为93.0％～99.5％,LTR基因同源性为92％～95％,pol基因同源性为97％～99％,gag基因同源性为94％～97％.根据该毒株序列和质粒pUC19的序列,将SCGS-1株前病毒cDNA全序列分3段克隆入pUC19中,构建含SCGS-1前病毒cDNA的重组载体并命名为pUC-SCGS.试验结果为研究ALV-J的进化规律和开展反向遗传操作打下基础.