哈维氏弧菌RT-LAMP检测方法建立与应用

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起海南省后水湾深水网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)"烂身病"的主要病原菌。为了能够快速诊断该病原菌,急需建立一种耗时短、准确以及便捷的检测方法。本研究利用分离到的致病菌株QT520的ToxR基因序列设计特异性引物和加入SYTO-9特异荧光染料,建立了一种可以实时、快速检测哈维氏弧菌的LAMP法(RT-LAMP)。该方法对哈维氏弧菌的基因组DNA及菌液灵敏度分别为100 fg/μL和10~3 cfu/mL,与Real-time PCR法检测灵敏度相当,比普通PCR的检测灵敏度要分别高1000倍和10倍,能有效区分哈维氏弧菌与坎氏弧菌(Vibrio campbellii);可以实时观察检测结果,且检测时间只需要40 min;具有耗时短、特异性和灵敏度高、仪器便携、操作简单且能实时观察检测结果等优点,非常适合在生产现场进行哈维氏弧菌的检测。     

免疫多糖对日本蟳抗溶藻弧菌能力的影响

通过对日本蟳(Charybdis japonica)分别注射生理盐水(对照组)、溶藻弧菌(攻毒组)、免疫多糖(免疫组)、免疫多糖+溶藻弧菌(免疫攻毒组)后,再测定4组肝胰腺及肌肉中溶菌酶(LZM)和超氧化物岐化酶(SOD)的活性变化,探讨免疫多糖对日本蟳抗溶藻弧菌能力的影响。结果表明:日本蟳肝胰腺中LZM和SOD的酶活均高于肌肉中的酶活,且免疫多糖对肝胰腺的免疫增强效应显著高于肌肉;免疫组肝胰腺和肌肉中LZM酶活,在注射后24h时显著升高至峰值(P<0.05),分别为(11.2±2.78)U/mg和(3.75±1.05)U/mg,肝胰腺和肌肉中的SOD酶活也在24h达到最高值,分别是对照组的2.2倍和1.4倍;免疫攻毒组在72h时,肝胰腺和肌肉中的LZM酶活分别高出攻毒组62.8%和75.2%,两组织中SOD酶活同样显著高于攻毒组(P<0.05),是攻毒组的3.5倍和4.2倍。由此可见,免疫多糖能提高日本蟳抗溶藻弧菌能力,且在72h达到最佳免疫保护效果。     

Damage to the Membrane Permeability and Cell Death of Vibrio parahaemolyticus Caused by Phlorotannins with Low Molecular Weight from Sargassum thunbergii

ABSTRACT

To understand the mode of action of low molecular weight phlorotannins (LMPs) from Sargassum thunbergii against Vibrio parahaemolyticus, effects of LMPs on the growth curve and the content changes of some substances in culture media were investigated, and those on morphological and ultramicrostructure were also observed by scanning electron microscope and transmission electron microscopy. The results showed that LMPs inhibited thalli growth at logarithmic phase and damaged the cell membrane and cell wall of tested bacteria which led to the leakage of cytoplasm and the deconstruction of membrane permeability. The present study indicates that LMPs as natural products in seaweeds deserve further investigation for food safety control and aquacultural drugs.     

哈维氏弧菌Y91301菌株培养工艺的研究

用大黄鱼分离的哈维氏弧菌Y91301进行试验,研究接种浓度、培养瓶装液量、起始pH值、培养时间、培养温度和培养液配方等因素对菌株生长的影响,确定静置培养时最适条件为:接种母液浓度1×108～1×109cfu ml,接种量6%～8%(相对培养瓶装液量),装液量40～50ml 250ml,培养液初始pH值为6 0～6 5,培养温度28℃;使用Zobell2216E培养配方更适合大量培养和生产的需要;旋转培养能够获得更高的生物量。     

养殖大菱鲆肠炎病的流行病学和病原学研究

[目的]肠炎病是目前大菱鲆养殖行业中比较常见的疾病之一,该病感染率高,传播迅速。[方法]从山东半岛3个不同的养殖厂肠炎病发病大菱鲆体内分离致病菌,对其进行了常规生理生化特征测试和16S rRNA基因序列对比研究。[结果]从发病大麦鲆体内共分离到了株优势细菌。理化特征分析结果显示这3株菌中有2株分别与溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)表型特征非常相似,另1株细菌被证实为非弧菌属的细菌,具体定种尚需进一步研究。分析这2株弧菌属细菌的16S rRNA基因序列并构建了系统发育树,结果表明这些菌株与溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的亲缘关系最近。[结论]从发病大菱鲆体内分离菌株的2株细菌被鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)。     

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ML01株胞外产物及分泌性蛋白的分离与特性分析

本研究以引起珍珠龙胆石斑鱼[Epinephelus fuscoguttatus(♀)×Epinephelus lanceolatus(♂)]幼鱼“皮肤溃疡病”的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ML01株为研究对象,采用平板膜覆盖技术和柱层析技术,分离、纯化了ML01株的胞外产物及分泌性蛋白.应用毒性试验、质谱分析与分子克隆技术,对纯化的胞外产物和3种主要的分泌性蛋白进行了特性分析与鉴定.结果显示,哈维氏弧菌ML01株的胞外产物(Extracellular products,ECPs)具有酯酶、明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶活性,无脲酶活性.ECPs对羊红细胞无溶血性,对斑马鱼(Danio rerio)的半数致死剂量(LD50)为19.55μg/g鱼体重.从ML01株中分离到3种主要的分泌蛋白P42、P36、P31,其分子量分别为42、36、31 kDa.经质谱鉴定和分析,这3种蛋白分别为哈维氏弧菌的外膜蛋白OmpU和OmpN,以及一种功能未知的蛋白.利用同源克隆,成功地从ML01株基因组中扩增到了P42、P36、P31的基因.序列测定和比对结果显示,ML01株的这3个基因与哈维氏弧菌ATCC 33843(GenBank CP009467)的相应基因相比,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列的相似性分别为97.08％、100％、99.67％,其编码的多肽序列的相似性分别为99.71％、100％和99.93％.本研究对进一步分析哈维氏弧菌ML01株的致病机理、研发该菌的亚单位疫苗具有重要的参考价值.     

一株大黄鱼致病性溶藻弧菌的耐药性及耐药基因分析

对一株分离自大黄鱼的致病性溶藻弧菌进行耐药性分析,分别用纸片扩散法、倍比稀释法检测了该菌对磺胺甲噁唑、氟苯尼考、盐酸多西环素、红霉素、盐酸环丙沙星、土霉素、恩诺沙星、硫酸新霉素、氨苄西林钠共9种药物的耐药性,同时用PCR法检测了该菌β-内酰胺酶基因bla CTX-M,喹诺酮类耐药基因(qnrVC,qnrVC5),四环素耐药基因(tetS、tetM)等耐药基因的携带情况。结果表明该菌对氨苄西林钠等药物耐药。对氟苯尼考、磺胺甲噁唑高度敏感。同时该菌携带bla CTX-M,qnrVC 2种耐药基因。本研究的结果为溶藻弧菌病的精准用药提供了数据支持。     

Antibacterial activity in microalgae cultures

Five cultures of microalgae (Chlorella minutissima, Tetraselmis chui, Nannochloropsis sp., Arthrospira platensis and Isochrysis sp.) with no culturable bacteria were tested for their ability to inhibit the growth of six Vibrio bacterial strains (V. parahaemolyticus, V. anguillarum, V. splendidus, V. scophthalmi, V. alginolyticus and V. lentus). The influence of light on the antibacterial activity of the microalgae was investigated. All microalgae cultures inhibited the growth of bacteria compared with the control treatments (P < 0.05), and their antibacterial activity was not influenced by the presence or absence of light. In the control groups, the numbers of bacteria increased exponentially during the experimental period in the absence of microalgae cells demonstrating that the bacterial cells were able to utilize the growth medium of microalgae cultures. The present results may explain the low levels or absence of Vibrio strains in microalgae cultures, and the positive effect of addition of microalgae in rearing of fish larvae, and implicate the production of antibacterial compounds by microalgae cells.     

凡纳滨对虾ARMC8基因的克隆及表达

为了研究含Armadillo重复蛋白8在凡纳滨对虾抗病感染过程中所起的免疫作用,本实验采用RACE-PCR技术首次克隆得到凡纳滨对虾ARMC8基因(LvARMC8,Gen Bank注册号:KX058562)的c DNA序列全长,并利用在线软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(Rt-PCR)技术对LvARMC8基因在凡纳滨对虾不同组织及感染白斑综合征病毒和副溶血弧菌过程中的表达变化特征进行分析。结果显示,LvARMC8基因全长为2917bp,其中开放阅读框长2046 bp,编码681个氨基酸,5′非编码区长49 bp,3′非编码区长822 bp。预测分析显示LvARMC8编码的蛋白质含有6个ARM结构域。同源性分析发现,LvARMC8基因与内华达古白蚁ARMC8基因的相似度最高,为71%。系统进化分析结果显示,LvARMC8和多种无脊椎动物ARMC8聚为一支,其中与昆虫类动物赤拟谷盗、致倦库蚊和柑橘凤蝶的亲缘关系最近。Rt-PCR分析发现,LvARMC8基因在凡纳滨对虾多个组织中均能检测出,在表皮中表达量最高,眼柄中表达量最低。WSSV感染后12 h,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量显著降低,但48 h后显著升高,72 h达到最高水平。除副溶血弧菌感染后24 h外的时间点,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量均显著升高。研究表明,LvARMC8基因可能参与凡纳滨对虾抗病免疫应答途径。     

鳗弧菌感染对日本鑚部分免疫活性因子的影响

对日本蟳(Charybdis japonica)进行鳗弧菌(Vibrio anguillarum)悬液和生理盐水(对照)注射感染,研究其血清免疫因子超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)活性的变化,并对试验结果进行统计学分析。结果表明,注射鳗弧菌悬液组SOD活性12、24、48h均高于对照组,48h达到最高;CAT活性12、24h增加非常明显,12h达最高;AKP活性5、12、24h都有增加,均高于对照,24h最高;ACP活性12h开始上升,24h达最高。在人工感染鳗弧菌48h内,日本蟳体内的免疫因子发生了明显的变化,血清中SOD、ACP、AKP、CAT活性在不同时间段均有显著升高趋势,高于对照组水平。