犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异性和灵敏性良好,最低核酸检出量为2拷贝·μL^-1,其敏感性比常规PCR高1000倍。分别采用纳米PCR和常规PCR,对广西、北京、吉林送检的75份疑似CPV的临床样品进行检测,CPV阳性率分别为89.3%(67/75)和70.7%(53/75),表明该方法具有更高的敏感性,适用于CPV低含量临床样品的检测。本方法的建立为CPV感染的早期快速、灵敏、准确的诊断提供了新方法,为CPV的防控奠定基础,具有重大的临床应用意义和价值。     

鸡传染性法氏囊病超强毒VP1基因的原核表达及兔抗血清的制备

以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株基因组RNA为模板,通过RT-PCk扩增VP1基因,经EcoRI和和Xho I双酶切处理后与经相同酶切处理的pET-30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及测序鉴定正确的阳性重组子转化BL21(DE3)感受态细胞,融合蛋白His-VP1经IPTG诱导表达后主要以包涵体形式存在.Western blot检测到约97 ku的目的蛋白能够与特异性的VP1单克隆抗体反应.将纯化的目的蛋白免疫新西兰白兔后获得了抗VP1蛋白的血清.该血清能够与重组杆状病毒rBacGxVP1感染的sf9细胞发生特异性反应,而且其ELISA抗体效价达到1:25 600.鸡传染性法氏囊病超强毒VP1基因的表达与兔抗血清的制备为病毒的检测及VP1功能的研究提供了有效工具.     

一株犬细小病毒的分离及VP2基因序列分析

采集病犬的粪便,经处理后接种狗肾传代细胞系（MDCK）,培养96h无任何细胞病变,盲传到第3代时细胞系出现明显的细胞脱落,核圆缩,形成CPE（cytopathic effect）。继续传代到第7代。第1、2代的细胞培养物不能凝集猪的红细胞,第3代以后的细胞培养物可以凝集猪的红细胞。采用PCR技术,在各代次的培养物中均能扩增得到特异性的DNA片断,经序列测定后鉴定为犬细小病毒,定名为BJY06。为进一步研究该分离株的遗传演化情况,扩增得到了VP2基因的全序列。经序列测定,用DANStar软件分析表明BJY06毒株为CPV-2a亚型,所得到的VP2基因全长1755bp,含有完整的阅读框架,编码584个氨基酸。与其它亚型的毒株相比较核苷酸的同源性为98.3%～99.6%。氨基酸同源性为97.1%～100%。     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,采用RT—PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89．5％～98．9％之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98．9％;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98．2％～99．5％之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。     

2株鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离鉴定

用分离的疑为鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)超强毒株 (vv IBDV) He B- lf和 He B- bd接种 SPF鸡 ,36 h后接种鸡开始发病 ,发病率为 10 0 %,死亡率为 5 0 %以上。剖检可见与野外病例相同的病理变化 ,如肌肉、心脏、腺胃出血 ,法氏囊水肿或呈“紫葡萄”样外观。经血清学试验、毒力试验、鸡胚接种试验、分子生物学和电镜形态学观察均证明该两分离物为超强毒株 ,从而证明河北省鸡群中存在不同于经典 IBDV的超强毒株。     

抗蓝舌病病毒VP7和NS2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为建立蓝舌病病毒(BTV)的检测方法和研究该病毒蛋白的功能,本研究利用BTV血清8型(BTV8)免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备单克隆抗体(MAb).并以BTV8作为包被抗原建立间接ELISA方法,经筛选获得了8株稳定分泌抗BTV8 MAb的杂交瘤细胞株(1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4和4D12).Western blot结果显示,MAb 1F6、2B1、2D10、3B6、3D9与BTV8 VP7蛋白反应,MAb B2、4D4、4D12与BTV8 NS2蛋白反应.间接免疫荧光结果显示,该8株MAb与24型BTV血清型呈不同的反应论系.本研究所获得的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究提供了实验依据.     

O型、A型及Asia1型3个型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测方法的建立

为了建立针对流行于我国及周边国家主要口蹄疫病毒(FMDV)血清型的检测方法,本实验设计2对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时扩增O型、A型及Asia1型FMDV VP1全基因的套式RT-PCR (RT-nPCR)方法.该方法能特异性检测O型、A型和Asia1型FMDV,对其它相关动物病毒的检测结果均为阴性;比FMDV多重RT-PCR商品试剂盒敏感约1 000倍.利用该方法对10份FMDV样品进行扩增检测,结合扩增产物的克隆测序技术,对所检样品进行了准确定型.实验结果表明,该方法通用型强,可用于3个血清型FMDV的检测和分子流行病学调查.     

鸡贫血病病毒长春株VP3基因的克隆及序列分析

采用PCR扩增方法成功克隆了鸡贫血病病毒（CAV）长春分离株的VP3基因，并进行了核苷酸序列测定，通过与TK5803、SJ1株进行序列比较，发现长春分离株VP3基因与TK5803仅有1个碱基差异，而氨基酸序列完全相同，与山东SJ1株有3个碱基差异和3个氨基酸差异。     

猪轮状病毒重组VP7蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

本研究以纯化的原核表达的猪轮状病毒VP7抗原表位区域为抗原,建立了检测猪轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法。特异性试验表明,该抗原与其他7种常见猪病病毒（TGEV、PEDV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV、PrV）的阳性血清不发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10％;对来自不同猪场的血清的检测结果表明,该ELISA方法与中和试验检测结果符合率达94．8％。本试验建立的ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和轮状病毒流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。