马立克氏病病毒VP22基因siRNA筛选体系的构建

将马立克氏病病毒（MDV）超强毒株VP22基因插入真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的下游，构建EGFP-VP22融合基因真核表达载体pEGFP-VP22。将其转染至中国仓鼠卵巢细胞（CHO-k1）中，通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并用RT-PCR检测VP22基因的表达。检测证实EGFP和VP22在CHO细胞中均得到了有效表达。     

生物杀虫剂强敌-312防治烟叶仓储害虫的试验与示范

2002年调查表明,黔东南州烟叶调拨站烟叶仓储库区危害烟叶的主要害虫种类有烟草粉螟和烟草甲2种。选用几种杀虫剂对其进行防治效果比较试验,结果表明:强敌-312WP 50 g 80%敌敌畏EC 250 mL处理区防治效果最好,药后7 d,防治效果达93.56%~96.79%,平均为95.18%;药后15 d,防治效果达90.67%~92.82%,平均为91.75%;药后30 d,防治效果达88.20%~89.53%,平均为88.87%,均显著高于其它4个处理区的防治效果。强敌-312WP 50 g 80%敌敌畏EC 250 mL在大面积防治示范区对2种害虫的防治效果,在仓储烟叶区,空仓地面和包装麻片上的防治效果相近,药后7 d,防治效果在89.66%~93.75%,平均为91.29%;药后30 d,防治效果达92.5%~100%,平均为95.19%;药后90 d,防治效果仍保持在75.00%~86.67%,平均为81.03%。试验示范证明,强敌-312WP 50 g 80%敌敌畏EC 250 mL是防治危害仓储烟叶烟草粉螟和烟草甲的最有效药剂和浓度。该药剂符合高效、低毒、低残留,对人畜安全的现代农药要求,在储烟库区有较好的推广前景。     

鹅细小病毒四平分离株VP3基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)核苷酸序列,设计并合成了1对引物,对吉林农业大学预防兽医学研究室分离鉴定的GPV四平株(SP)主要保护性抗原蛋白VP3基因进行扩增。所得到的PCR产物片段大小约1.6 kb,与预期片段大小相符。将该片段纯化后与T载体连接,转化到感受态大肠杆菌JM-109中进行克隆。对所提质粒进行快速鉴定、PCR鉴定以及限制性内切酶NheⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒,对重组质粒测序并进行核苷酸序列分析。结果表明:GPV四平株VP3基因长1 605 nt,包含了完整编码GPV VP3蛋白阅读框,且与国内GPV分离株B,GD,HG5/82相应核苷酸序列和氨基酸序列的同源性较高,分别为96.2%,96.3%,96.4%和97.4%,98.7%,98.9%。据此认为,GPV四平株VP3基因可以作为构建具有普遍应用价值的基因工程疫苗的候选基因。     

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的构建

利用Oligo设计合成一对引物P1、P2,分别含有BamHI和XhoI酶切位点,以猪细小病毒株LJL12的DNA为模板,采用PCR技术扩增VP2基因,克隆到pMD18-TSimple载体,并进行酶切、PCR鉴定和序列测定。将VP2基因分别亚克隆到干酪乳杆菌细胞表面表达型载体pPG1和分泌型表达载体pPG2的BamHI和XhoI酶切位点,电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei393,获得阳性重组菌株。成功构建了猪细小病毒VP2蛋白的干酪乳杆菌表达系统,命名为pPG1-VP2/L.casei393和pPG2-VP2/L.casei393。     

传染性法氏囊病病毒超强毒地方株HN01的分离鉴定及分子系统进化分析

用分离的疑为鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒(vvIBDV)地方分离株HN01,经处理后接种SPF鸡,36h后接种鸡开始发病,发病率为100%,死亡率为70%以上。剖检可见与野外病例相同的病理变化,如肌肉、腺胃、心脏出血,法氏囊水肿且多呈"紫葡萄"样外观。经血清学试验、毒力试验、鸡胚接种试验、分子生物学和电镜形态学观察均证明该分离物为超强毒株,从而证明河南省鸡群中存在不同于IBDV一般强毒株、经典株和变异株的超强毒株。通过对IBDV不同毒株VP2基因高变区氨基酸序列的聚类分析发现,HN01与华南超强毒株G9201、欧洲超强毒株UK661关系最接近,而与HK46,OKYM,D6948,UPM92-04和KS等毒株关系依次渐远。     

水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达

根据GenBank中已发表的水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因核苷酸序列分别设计合成两对引物,用PCR方法扩增ADV国内分离株VP2基因中主要抗原表位区的两个片段,分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中。经酶切、PCR扩增和测序分析证实其已正确插入到表达载体中,且阅读框是正确的,构建原核表达载体pMAL-VPa和pMAL-VPb。阳性重组质粒转化宿主菌TB1,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE检测和免疫印迹分析。结果表明两段蛋白均获得了表达,表达产物的分子质量分别约为63、65kD,与理论推测的分子质量一致;并在终浓度为1mmol/L的IPTG诱导下,4h时其表达量达到高峰;Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识别,具有一定的抗原性。     

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDV VP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25 d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.     

牛轮状病毒VP4基因与LTB基因的融合表达及免疫原性研究

PCR扩增轮状病毒VP4基因和大肠杆菌LTB基因编码区,将其克隆至pET32a载体上,构建pET32a-VP4-LTB质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),PCR、酶切鉴定后进一步测序,测序结果表明融合基因片段由2637 bp组成,为编码879个氨基酸残基的多肽。经IPTG诱导和SDS-PAGE检测发现表达产物分子量约为118.9 KD,以包涵体的形式存在。融合蛋白经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化后免疫小鼠,结果所产生的抗体效价高于单独VP4蛋白的免疫结果但差异不显著(P0.5),但与对照组相比差异显著。表明所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性,为研制牛轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

表达鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建与鉴定

[目的]构建表达鹅细小病毒 （GPV） VP3基因的重组腺病毒,为机体免疫试验和免疫效果评价奠定基础.[方法]以重组质粒pcDNA-VP3为模板,以GPV-VP3为目的基因,构建GPV-VP3重组腺病毒载体,通过转染获得能稳定表达GPV-VP3基因的重组腺病毒,通过IFA和Western-blot检测GPV-VP3基因的表达情况.[结果]扩增到的GPV-VP3基因全长为1 605 bp,线性化的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293细胞中瞬时表达GPV-VP3基因,表达蛋白的分子量约为60Ku.[结论]该重组腺病毒的构建将为GPV新型疫苗研发和后期体内试验奠定基础.     

胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因的克隆和表达

通过RT-PCR方法扩增出MPZJ1206株胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因,将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接获得重组表达质粒pGEX-VP1,进行条件优化诱导表达,将表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析。结果表明,分子量约为52 kDa的重组目的蛋白得到表达。该研究为开发胰腺炎型鸭1型甲肝病毒诊断方法和研究VP1蛋白功能奠定基础。