草地贪夜蛾Sf9细胞对饥饿诱导自噬的响应

为研究草地贪夜蛾对饥饿诱导自噬的响应。从草地贪夜蛾EST数据库中筛选到一段核苷酸序列,设计特异性引物,RT-PCR技术从草地贪夜蛾Sf9细胞中扩增该核苷酸序列,经过生物信息学分析该序列与昆虫自噬相关基因ATG8同源性最高,命名为SfATG8基因,并构建了pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8载体转染Sf9细胞。Sf9细胞经饥饿(PBS)诱导4 h后,Lyso-Tracker染色、Western Blotting、共聚焦显微镜检测细胞对自噬的响应程度。结果表明,经饥饿(PBS)诱导4 h的Sf9细胞中出现Sf Atg8-PE的表达,共聚焦显微镜检测到Sf9细胞膜上的自噬小体。以上证据证实饥饿(PBS)能诱导Sf9细胞发生自噬,为深入研究Sf9细胞对自噬的响应奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsCOL9水稻突变体

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。     

高产优质水稻新品种9香优007的选育

9香优007系铜仁鑫天地农业发展有限公司利用自育恢复系铜恢007与自育不育系9香A杂交选育的新品种.主要特点是:米质优、抗性强、丰产稳产性好.具有较好的推广前景.     

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及序列分析

以大豆基因组文库Phytozome公布的大豆Williams82基因组序列为参考,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,用PCR技术扩增了大豆GmWRI1a基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGM-TpGmWRI1a,并通过PCR扩增对阳性克隆进行鉴定送测序。克隆获得GmWRI1a基因启动子序列1 686bp,该启动子序列除含有必需的起始转录位点、TATA-box、CTTA-box外还包含多个顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素应答元件、表达分生组织相关元件、抗旱诱导元件等。同时,构建了该启动子植物表达载体pBI-pGmWRI1a,通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定,为启动子的功能研究奠定基础。大豆GmWRI1a基因启动子克隆与序列分析,将为进一步研究大豆GmWRI1a基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

稻瘟病菌F-box蛋白MoFbr7生物学功能分析

F-box蛋白在泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)中参与调控胞内蛋白降解、受体识别、信号传导等生物学过程。本研究从稻瘟病菌中克隆了F-box基因MoFbr7,序列分析表明,该基因编码产物具有1个F-box结构域(N-端)和8个连续的WD40重复序列(C-端),在丝状真菌中高度保守。利用基因敲除方法,获得4个MoFbr7基因敲除突变体,同时构建了回补菌株。表型分析结果显示,MoFbr7基因缺失突变体在产孢量、附着胞形态、原生质体释放、致病性等方面均无异常。突变体在MM、RDC培养基上生长速率下降;对细胞壁胁迫因子CFW(Calcofluor white)、刚果红敏感。以上结果表明MoFbr7参与稻瘟病菌的营养生长与细胞壁完整性,为进一步揭示其生物学功能奠定基础。     

云南省元阳县籼/粳型稻瘟病菌无毒基因Avr-Pia、Avr-Pita1和Avr-Pii多样性分析

为明确云南省元阳县籼/粳型稻瘟病菌中无毒基因的多样性及差异,采用接种鉴别品种方法和PCR技术对9株粳型菌株和21株籼型菌株中无毒基因Avr-Pia、Avr-Pita1和Avr-Pii的多样性进行分析。结果显示,30株稻瘟病菌菌株中无毒基因Avr-Pia、Avr-Pita1和Avr-Pii的平均出现频率分别为33.3%、76.7%和0,Avr-Pia、Avr-Pita1在籼型菌株和粳型菌株中的出现频率分别为4.8%和100.0%、66.7%和100.0%。Avr-Pia主要为存在/缺失的多样性,籼/粳型菌株对水稻品种Achiasahi(Pia)的致病率分别为100.0%和11.1%;Avr-Pita1可划分为3个类群,除菌株CH1195属于PO类群外,籼型菌株均属于J1类群,粳型菌株则属于J2/J3类群;籼/粳型菌株对水稻品种K1(Pita)的致病率分别为100.0%和0,且籼/粳型菌株Avr-Pita1蛋白序列在第83位和第192位氨基酸差异明显。Avr-Pii在30株稻瘟病菌菌株中均未检出,籼/粳型菌株对水稻品种Fujisaka No. 5(Pii)的致病率分别为100.0%和0。表明Avr-Pia和Avr-Pita1在粳型菌株中的出现频率高于籼型菌株且变异程度低,粳型菌株中可能存在其它无毒基因使其不能侵染Fujisaka No. 5。     

韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白基因的克隆及光强度对其表达量影响

为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用qPCR技术检测了不同发育阶段、不同组织及不同光强度下Bo-uv基因的相对表达量。结果表明,Bo-uv基因cDNA全长2 757 bp,开放阅读框1 542 bp,编码514个氨基酸。韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为21.93%～43.00%,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的氨基酸序列同源性最高。Bo-uv基因在韭菜迟眼蕈蚊蛹末期、成虫期表达,在成虫头部的相对表达量较高。在0～10 000 lx光强范围内雌、雄成虫体内该基因的相对表达量均呈先增高后降低趋势。与对照相比,1 000 lx光强度下其相对表达量显著升高,10 000 lx时相对表达量显著降低。表明光强度能够有效地调控Bo-uv基因的表达,该基因在韭菜迟眼蕈蚊感知外界光刺激过程中具有重要作用。     

黏虫CYP9A113基因的克隆及外源物质对基因表达的诱导效应

黏虫是我国作物上最重要的害虫之一。细胞色素P450能够参与昆虫外源物质代谢。本研究采用RACE技术克隆了一条编码黏虫P450基因的cDNA序列,并通过Real-time PCR技术,检测了4种外源物质对该基因表达的诱导效应。该基因被国际P450命名委员会命名为CYP9A113,GenBank登录号为KY436739。利用2.5%高效氯氟氰菊酯乳油的LD_(50)处理黏虫3 h,LD_(10)、LD_(30)和LD_(50)处理12 h和24 h,可诱导表达CYP9A113基因;20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂的LD_(10)处理黏虫12、24和48 h,LD_(30)和LD_(50)处理24 h,CYP9A113基因表达呈诱导效应;0.1和0.5 mg/mL香豆素处理6、12、24和48 h,CYP9A113基因表达均呈诱导效应;0.1和0.5 mg/mL吲哚-3-甲醇处理3、6、12、24和48 h,CYP9A113基因表达均呈诱导效应。     

氯虫苯甲酰胺和氟虫腈对黏虫细胞色素P450基因表达的影响

为筛选出黏虫Mythimna separata参与杀虫剂解毒代谢的主效细胞色素P450基因,采用叶片浸渍法测定了用于处理黏虫3龄幼虫的亚致死浓度,通过构建转录组测序文库并结合数字基因表达(digital gene expression,DGE)对不同处理的黏虫进行测序,并运用实时荧光定量PCR(realtime quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术验证12个P450基因的表达情况。结果表明,用于处理黏虫的氯虫苯甲酰胺和氟虫腈亚致死浓度LC_(10)分别为0.15、13.66 mg/L;对照样品、氟虫腈处理样品和氯虫苯甲酰胺处理样品分别获得59 521 504、64 838 148和41 722 990个原始序列数据,分别获得57 441 216、62 368 912和40 285 164个过滤后的序列数据;过滤后的序列长度分别为8.62、9.36和6.04 G;碱基错误率均为0.02%;Phred数值大于20、30的碱基占总碱基的百分比均高于90.59%;鸟嘌呤+胞嘧啶(guanine cytosine,GC)含量分别为47.16%、48.94%和47.55%,表明转录组测序质量较高;黏虫受氯虫苯甲酰胺胁迫后,29个P450基因表达量上调,27个P450基因表达量下调;黏虫受氟虫腈胁迫后,23个P450基因表达量上调,26个P450基因表达量下调;12个P450基因表达量的RT-qPCR技术检测结果与DGE测序文库显示的结果基本一致。     

高效氯氰菊酯对小鼠卵巢生殖功能的影响及维生素E的干预作用

为探究高效氯氰菊酯 (beta-cypermethrin, β-CP) 对雌性小鼠卵巢生殖功能的影响及维生素E (vitamin E, VE) 的干预作用,将雌性昆白小鼠随机分为6 组:空白对照组 (花生油处理)、β-CP不同剂量 (10、20、40 mg/kg) 处理组、VE保护组 (20 mg/kg β-CP+20 mg/kg VE) 和VE组 (20 mg/kg VE),连续灌胃10 d。灌胃结束后取小鼠卵巢组织,观察组织结构的病理变化,采用免疫组化法、蛋白免疫印迹试验及RT-PCR方法检测卵巢中StAR蛋白含量及casp-3、casp-8、INHα和INHβB 基因mRNA表达的变化。结果显示:与对照相比,10、20和40 mg/kg的β-CP处理均使小鼠卵巢组织结构发生了损伤,使组织中StAR蛋白的浓度分别降低了18.8%、36.3%和40.3%,casp-3基因的表达分别升高了16.0%、26.7%和52.9%,INHα基因的表达分别升高了34.5%、83.6%和228.7%,INHβB基因的表达分别升高了7.5%、39.2%和52.7%;20和40 mg/kg的β-CP处理使得casp-8基因的表达分别升高了27.1%和36.7%。上述处理组与对照组的差异均达显著水平 (P＜0.05)。与 20 mg/kg β-CP处理组相比,VE 保护组的StAR蛋白含量也显著增多 (P＜0.05)。研究表明,β-CP对小鼠卵巢具有毒性作用,这与β-CP抑制StAR蛋白的合成,上调casp-3、casp-8、INHα及INHβB基因的表达有关;添加VE对小鼠卵巢有一定的保护作用,这与VE可减弱β-CP对StAR蛋白合成的抑制作用有关。