粳稻中花11 T-DNA插入突变体的分离和鉴定

通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法,对中花11成熟胚愈伤组织进行T-DNA转化,构建了含1489个独立的再生转化株系的突变体库,不仅为水稻功能基因组提供了一个有效的研究平台,还创造了一些具有优良农艺性状的突变材料,为水稻育种提供新的基因资源。插入第1代单本移栽且单本收获,第2代播种1066个家系,在水稻各个生育阶段从中独立筛选得到各类外形突变体66个。经过第三代重复筛选获得包括茎、叶、花和穗变异等各类突变52份。结果表明,外观性状的突变频率为3.4%。     

插入T-DNA片段构建部分水稻突变体株系

 通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导,将T-DNA片段高效插入水稻中花11的基因组DNA中。利用二次枝梗种子和未成熟种子的盾片愈伤组织作为转化起始物,探索并优化了影响愈伤组织诱导率、再生率和转化率的试验条件,得到近10 000株转化植株。经PCR分析和Southern 杂交证明已将外源基因整合到水稻基因组中。当代转基因植株可抗0.2%的除草剂Basta。200余棵T0代转化株系出现白化苗、宽叶、狭叶、黄叶、高秆、矮化并杂草化、不育、白化穗、皱穗和抽穗延迟等突变表型,结实率普遍较低     

棉花黄萎病菌插入突变体库的构建及致病相关基因DVK1的克隆与鉴定

 利用ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）技术自建Verticillium dahliae强致病力落叶型菌株T-DNA插入突变体库,共获得5000个转化子;随机挑选1000个转化子进行致病力鉴定,筛选获得5株致病力衰退的突变体。挑选致病力下降最为明显的突变体d1,通过TAIL-PCR技术最终获得一段长3237 bp的DVK1全长cDNA序列,编码1079个氨基酸的蛋白。基于DNA序列比对发现,DVK1基因含有2个内含子,分别为52 bp和36 bp。进一步比对发现T-DNA插入到DVK1基因启始密码上游740 bp的启动子中。通过遗传互补实验d1 恢复了致病性,进一步证明DVK1基因与黄萎菌致病性相关。     

Optimizing Culture System of Ri T-DNA Transformed Roots for Citrus grandis cv. Changshou Shatian You

Genetic transformation experiments of the different explants from Citrus grandis cv. Changshou Shatian You infected with Agrobacterium rhizogenes were carried out in darkness or in light. The optimizing culture system of Ri T-DNA transformed roots for C. grandis cv. Changshou Shatian You was constructed as follows: After the ventral wounded striations on the single activation cotyledon were inoculated by A. rhizogenes A4 (logarithmic period), they were cocultured at (25 ± 2)°C in darkness for 25–30 days; some transformed roots were generated from wounded striations of most cotyledons. The genetically transformed ratio is (83 ± 11)%. Axenic Ri T-DNA transformed roots (hairy roots) were harvested after five subcultures. Explants were activated on MT medium. The MS medium was used for subculture of transformed roots. Mass Ri T-DNA transformed roots in which the hormone was produced independently were harvested from this optimizing culture system. White, fresh Ri T-DNA transformed roots were (1.14 ± 0.07) cm long, (0.73 ± 0.04) mm wide, and the growth direction of transformed roots was negative geotropism.     

长寿沙田柚Ri T-DNA转型根优化培养体系研究

 设计了长寿沙田柚不同外植体在光、暗条件下进行发根农杆菌遗传转化试验，建立了长寿沙田柚Ri T-DNA转型根优化培养体系，该体系为：用对数期的发根农杆菌A4菌株感染活化胚中单片子叶的创伤腹面，25℃±2℃暗培养25～30 d，多数子叶上发出转型根（毛状根），遗传转化率达（83±11）%。继代脱菌5代后获得无菌转型根。外植体活化采用MT培养基，继代脱菌培养采用MS培养基。采用这个体系获得了大量激素自主的长寿沙田柚Ri T-DNA转型根。获得的新鲜转型根白色，长1.14±0.07 cm，粗0.73±0.04 mm，负向地性生长。     

利用dsRNA干涉方法研究水稻WRKY转录因子的抗病性

 为了研究植物WRKY基因编码的转录因子在水稻上的功能，构建了包含WRKY保守结构域的dsRNA发夹结构干涉载体，用农杆菌介导法转野生型水稻中花11，得到9个有干涉表型的株系。PCR和Southern结果表明dsRNA已整合入中花11的基因组中，且多数为单拷贝。结合T-DNA插入的WRKY突变体植株T456，研究了其中的3个干涉苗和T456对稻瘟病和白叶枯病的抗性，发现3个干涉苗对这两种水稻主要病害的抗性均明显强于T456和中花11，且T456比中花11略抗稻瘟病和白叶枯病，表明dsRNA干涉是成功的，它可能干涉或抑制了某些OsWRKY家族中负向调控抗病基因的成员。     

稻曲病菌突变体B-726生物学性状分析及其T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状,分析其T-DNA插入位点的侧翼序列,克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因,为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础,并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测,分析其生物学性状;Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数;利用HiTail-PCR 获得T-DNA插入位点的侧翼序列;运用RACE-PCR技术,克隆与插入位点毗邻的基因全长;用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著下降,产孢能力、生长速率显著下降。Southern杂交结果显示T-DNA在菌株B-726中以单拷贝形式插入。经过序列分析发现,T-DNA插入在1个命名为Uvt-726上游344 bp处,半定量PCR结果表明,Uvt-726在B-726表达量较P1显著下降。【结论】克隆了1个可能与稻曲病菌致病力相关的基因,推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要的作用。     

稻曲病菌T-DNA插入突变体5062的插入位点分析

【目的】研究稻曲病菌致病力增强的ATMT突变菌株5062,为稻曲病菌致病机制解析、致病相关基因克隆提供方法基础。【方法】测定和观察5062的菌落直径、菌落形态、产孢能力等生物学特性,进一步利用TAIL-PCR和RACE技术克隆5062基因组的T-DNA侧翼基因,并比对分析基因的信息,最后利用RT-PCR检测突变基因的表达量。【结果】与野生型菌株相比,突变菌株5062田间接种表现为致病力增强,在MM和水琼脂培养基上生长速率减慢,产生大量分生孢子,而在PSA和TB3培养基上,其菌落形态、色素等方面与野生型无明显差异。TAIL-PCR扩增得到的紧邻T-DNA两侧的侧翼序列在野生型中不相邻。TAIL-PCR结合RACE技术克隆了5062基因组的T-DNA侧翼基因,RT-PCR表明T-DNA插入位点右侧1个基因在突变体中上调表达。【结论】突变菌株5062的致病力增强,在营养贫乏条件下产孢能力增强,其表型的变化可能是染色体重排和T-DNA插入共同影响的结果。     

农杆菌介导球孢白僵菌转化体系的建立及突变体筛选

以球孢白僵菌(Beauveria bassiana)YB-06为受体菌株, 采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(pATMT1)介导的球孢白僵菌的遗传转化,并研究了转化介质和pH对转化效率的影响。结果表明:在采用28℃、200μmol/L的乙酰丁香酮(AS)、农杆菌浓度OD₆₀₀=0.8、孢子浓度为1×106个/ml、pH5.1~5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH5.3时,转化效率最高,达586个转化子/106分生孢子;不同共转化介质对转化效率影响明显, 玻璃纸和硝酸纤维素膜转化效率较高。对3000个转化子生长速度和产孢量等性状分析获得46个性状特异突变体。本文结果为进一步研究球孢白僵菌的生长发育、致病机理和毒力相关基因功能奠定了基础。