果胶乙酰酯酶基因 AtPae7参与拟南芥对大豆疫霉菌的非寄主抗病性

利用反向遗传学方法,鉴定拟南芥(Arabidopsis thaliana)对大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)非寄主抗病性相关的基因。通过分子生物学和生物信息学方法,鉴定和分析T-DNA插入拟南芥突变体离体叶片对大豆疫霉菌的非寄主抗病性。结果表明:4个果胶乙酰酯酶基因AtPae7(pectin acetyl esterase 7)突变体株系中的3个对大豆疫霉菌的抗性减弱,表现为感病;qRT-PCR检测表明突变体中AtPae7的转录水平下降;生物信息学预测PAE7蛋白的N端有23个氨基酸信号肽序列,确定其为胞外分泌蛋白。说明果胶乙酰酯酶基因AtPae7参与拟南芥对大豆疫霉菌的非寄主抗病性。     

哈茨木霉厚垣孢子产生突变体的筛选及T-DNA标签序列的克隆

利用PD液体培养基从哈茨木霉T-DNA插入突变体库中筛选出在产孢性状上与野生型菌株明显不同突变子7株,其突变表型主要表现在分生孢子产生数量显著减少和菌丝上有大量厚垣孢子分化.利用TAIL-PCR方法对7株突变体的侧翼序列进行克隆,从5个突变体中获取了5条T-DNA侧翼序列.为木霉菌厚垣孢子产生相关全长基因的克隆和产孢机制的研究奠定了基础.     

胶孢炭疽菌致病相关基因Plv2功能分析

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的橡胶树炭疽病是橡胶树三大叶部病害之一,严重威胁着橡胶树的生长。本研究从构建的胶孢炭疽菌RC178 T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱的突变菌株T1103,其T-DNA为单拷贝。采用TAIL-PCR克隆了该突变体T-DNA插入位点的侧翼序列,通过比对胶孢炭疽菌全基因组序列,发现该TDNA插入位点所在的序列包含一个5 400 bp的基因,将其命名为Plv2。Plv2基因包含3个外显子,编码一个假定的甾醇C-24甲基转移酶。敲除野生型菌株RC178中的Plv2,发现敲除突变体与T1103的致病力表现基本一致,由此推测Plv2基因为致病相关基因。     

水稻T-DNA插入氮营养缺陷型突变体的初步筛选

通过温室水培试验对根癌农杆菌介导的T-DNA随机插入构建的水稻突变体库的T1代2 173个家系进行筛选.以叶绿素SPAD值为指标,以苗期表观症状为参考指标,筛选到27个氮营养缺失的突变家系.对27个突变家系进行遗传分析、复筛及T2代鉴定,结果表明,编号955家系为氮营养缺陷型突变家系,且T2代能够稳定遗传.该材料通过进一步鉴定可用于分离、鉴定氮营养相关基因.     

利用农杆菌转化花椰菜组织的研究

供试的四个花椰菜品系对农杆菌T_(37)反应极为敏感,但各品系反应程度有所不同,肿瘤发生率变动于64%-82%之间。利用含有二元载体的农杆菌LBA_(4404)与无菌幼苗的下胚轴切段共培,获得卡拉霉素抗性植株。DNA分子杂交证明,二元载体上的T—DNA确实整合到植物染色体上,其npt嵌合体基因使转化体具有卡拉霉素抗性。由胭脂碱Ti质粒pTiT_(37)诱导的丛生芽,通过组织培养较易分化出不定根,但这些芽状结构很难发育成正常植株。     

利用二代测序技术对柔嫩艾美耳球虫T-DNA整合位点的分析及鉴定

为建立一种适用于转基因球虫的快速且准确的分析T-DNA整合位点的方法，本研究利用二代测序技术对转基因柔嫩艾美耳球虫EtM2e虫株进行基因组重测序分析，基于嵌合体reads比对分析T-DNA的插入位点，通过T-DNA特有序列以及外源基因与球虫同源序列的测序深度进而分析T-DNA拷贝数，最后利用PCR扩增验证分析位点。结果表明:1)二代测序下机数据过滤后获得数据7.2 Gb，Q20为96.1%，Q30为89.2%，能够比对至柔嫩艾美耳球虫参考基因组的reads数为23 992 361×2，平均测序深度为80×，reads全基因覆盖结果表明整个染色体被覆盖的较为均匀，测序的随机性比较好，可以进行后续分析；2)比对至T-DNA序列的reads数为3 106和3 036，平均测序深度为140×，嵌合体reads序列信息表明T-DNA只存在一个插入位点，位于HG994969.1:2 704 213~2 705 255；3)T载体骨架特有序列卡那抗性基因的平均测序深度为67×，T-DNA特有序列EYFP基因的平均测序深度为85×，而T-DNA与球虫同源序列His4基因的5′调控区序列的平均测序深度为154×，Actin基因的3′调控区序列的平均测序深度为164×，同源序列的平均测序约为特有序列平均测序深度的2倍，这表明T-DNA为单拷贝，与发现一个插入位点的结果相符合；4)经PCR验证分析成功鉴定了该整合位点。转基因艾美耳球虫EtM2e虫株T-DNA整合位点的鉴定为后续转基因球虫鉴定提供了技术平台，也为球虫活载体疫苗的研发提供了一个潜在的靶位点。