大规模T-DNA插入突变体筛选中所需T2代最小样本容量的确定方法

在利用T-DNA插入,大规模产生突变体的工作中,通常将一定数量的T1代植株混合收获,建立T2代种子池,然后以池为单位进行突变体筛选。本文提出了在一定概率保证下,确定突变体筛选所需的最小样本容量(种子数量)的方法,以期能够既不遗漏突变体,又不浪费人力物力。     

果胶乙酰酯酶基因 AtPae7参与拟南芥对大豆疫霉菌的非寄主抗病性

利用反向遗传学方法,鉴定拟南芥(Arabidopsis thaliana)对大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)非寄主抗病性相关的基因。通过分子生物学和生物信息学方法,鉴定和分析T-DNA插入拟南芥突变体离体叶片对大豆疫霉菌的非寄主抗病性。结果表明:4个果胶乙酰酯酶基因AtPae7(pectin acetyl esterase 7)突变体株系中的3个对大豆疫霉菌的抗性减弱,表现为感病;qRT-PCR检测表明突变体中AtPae7的转录水平下降;生物信息学预测PAE7蛋白的N端有23个氨基酸信号肽序列,确定其为胞外分泌蛋白。说明果胶乙酰酯酶基因AtPae7参与拟南芥对大豆疫霉菌的非寄主抗病性。     

水稻OsABC1K3突变体鉴定及其对强光胁迫的响应

【目的】强光胁迫能够抑制植物光合作用,严重时造成光合器官破坏,影响作物生长和产量。以T-DNA插入突变体为材料,研究水稻ABC1（activity of bc1 complex）激酶基因OsABC1K3响应强光胁迫的生理功能。【方法】根据水稻基因组注释数据库预测的OsABC1K3不同转录本共有序列设计引物,采用3′ RACE对OsABC1K3可变剪接进行验证;从水稻T-DNA插入序列数据库中获得该基因的T-DNA插入突变体osabc1k3,通过加代繁殖和PCR检测取得纯合突变体,调查突变体株高、结实率、种子大小等农艺性状,采用Arnon法测定叶片色素含量,利用LI-6400便携式光合测定系统测定抽穗期旗叶光合速率,采用透射电镜分析叶绿体超微结构;将生长于300 μmol·m^-2·s^-1光照强度下的野生型和突变体幼苗转移至800 μmol·m^-2·s^-1光照强度进行强光处理,观察植株表型,分析叶绿体超微结构和叶绿素含量变化;用含20 μmol·L^-1甲基紫精（MV）和0.1%吐温20的水溶液喷洒野生型和突变体幼苗叶片表面,以单独用0.1%吐温20喷洒的幼苗作为对照,观察叶片表型,测定处理后超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量;采用实时荧光定量PCR分析突变体淀粉合成、叶绿体异戊二烯基脂合成及叶绿体ABC1激酶基因的表达。【结果】OsABC1K3仅检测到一个转录本LOC_Os05g25840.3。osabc1k3突变体株高和结实率下降,种子变小,其中,粒宽下降了13.4%,粒厚下降了6.8%,千粒重下降了18.2%,而粒长与野生型无显著差异。突变体叶片叶绿素含量下降,而叶绿素a/b和类胡萝卜素含量高于对照。突变体叶绿体形态正常,但缺乏淀粉粒。光合活性分析表明,突变体叶片光合速率与野生型无显著差异。强光处理7 d后,突变体叶片发生黄化;9 d后,部分植株枯死。强光处理后突变体叶绿体类囊体结构紊乱,出现大量的空泡。进一步对叶绿素含量进行测定表明,突变体叶片叶绿素衰减程度显著高于对照。然而,MV处理后突变体叶片坏死程度、SOD活性及MDA含量与野生型无显著差异。此外,OsABC1K3突变影响了叶片淀粉合成、叶绿体异戊二烯基脂合成及叶绿体ABC1激酶基因的表达。【结论】OsABC1K3可能不参与水稻氧化胁迫的防御,而通过遗传控制的信号途径调控强光胁迫响应。     

哈茨木霉厚垣孢子产生突变体的筛选及T-DNA标签序列的克隆

利用PD液体培养基从哈茨木霉T-DNA插入突变体库中筛选出在产孢性状上与野生型菌株明显不同突变子7株,其突变表型主要表现在分生孢子产生数量显著减少和菌丝上有大量厚垣孢子分化.利用TAIL-PCR方法对7株突变体的侧翼序列进行克隆,从5个突变体中获取了5条T-DNA侧翼序列.为木霉菌厚垣孢子产生相关全长基因的克隆和产孢机制的研究奠定了基础.     

应用T-DNA标签进行基因功能分析的步骤和方法

概述了应用T-DNA标签进行基因功能分析的步骤及获得突变体后标签基因的分离方法,对应用T-DNA标签进行基因功能分析研究具有一定的参考价值。     

一个显性矮秆水稻突变体的获得及其遗传分析

 【目的】分析该研究组已发现的一个显性矮秆水稻突变体的遗传组成及背景。【方法】利用农杆菌介导法转化粳稻品种武香粳9号,产生T-DNA插入群体。在筛选和鉴定水稻T-DNA插入突变体的过程中,发现一个矮秆突变体。利用PCR扩增、Southern杂交等分子生物学方法对该突变体后代进行鉴定及遗传分析。【结果】突变体自交后代群体中出现矮秆和正常株高两种类型,分离比为3﹕1,符合一对显性单基因的遗传,并且矮秆性状的表现与T-DNA插入共分离。利用籼稻品种龙特甫与其纯合矮秆植株进行杂交,杂交F2代的矮秆株与正常株的比例同样呈3:1分离,符合一对显性单基因的遗传规律。利用SSR等分子标记,将该基因定位在水稻的第4染色体上。【结论】该矮秆性状由一对显性基因控制,由T-DNA插入引起,位于水稻第4染色体上,可作为进一步分离该基因的遗传材料。     

一株玉米弯孢叶斑病菌生长缓慢型突变株获得及T-DNA右翼序列分析

本试验采用农杆菌介导的遗传转化方法获得了1个菌落生长缓慢型的突变体,通过抗性基因(hph)的扩增及分子杂交验证了T-DNA以单拷贝的方式插入基因组中.对突变体的一些生物学性状与野生型CX-3比较,结果发现突变体的菌落生长速度是野生型CX-3的42%,其产孢量为野生弄CX-3的18%,但是对离体玉米叶片的致病力与野生型C...     

Identification of T-DNA Inserted Mutant Gene Transcription by Using Real-time PCR in Arabidopsis

AtERF4 (ethylene response factor) is a negative regulator in jasmonic acid mediated signal transduction pathway and ethylene mediated signal transduction pathway of Arabidopsis. It could respond to abscisic acid (ABA) and ethylene stimulus. ATSYR1 gene encodes a syntaxin localizing at the plasma membrane in Arabidopsis, which can be induced by abiotic stress. To identify mutation lines for gene functional analysis, real-time PCR was employed to detect the expression level of AtERF4 and ATSYR1 in homozygous ...     

胶孢炭疽菌致病相关基因Plv2功能分析

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的橡胶树炭疽病是橡胶树三大叶部病害之一,严重威胁着橡胶树的生长。本研究从构建的胶孢炭疽菌RC178 T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱的突变菌株T1103,其T-DNA为单拷贝。采用TAIL-PCR克隆了该突变体T-DNA插入位点的侧翼序列,通过比对胶孢炭疽菌全基因组序列,发现该TDNA插入位点所在的序列包含一个5 400 bp的基因,将其命名为Plv2。Plv2基因包含3个外显子,编码一个假定的甾醇C-24甲基转移酶。敲除野生型菌株RC178中的Plv2,发现敲除突变体与T1103的致病力表现基本一致,由此推测Plv2基因为致病相关基因。