通过优化gRNA设计提高CRISPR/Cas9系统中基因编辑效率的方法

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167a前体序列在线设计候选g RNA,同时结合体外编辑检测的方法筛选出能够在体外成功编辑的g RNA-G1,把其连接到含有荧光标记的pP1C.1C表达载体,转化番茄子叶,产生愈伤组织数116个,得到5个含有表达载体的材料,经测序发现,其中3个材料发生了编辑。结果表明,通过体外检测和在线软件设计相结合的方法来快速检测g RNA的编辑效率,能筛选出最优的g RNA用于载体的构建,与未采用体外编辑检测来设计g RNA的方法相比,显著提高了CRISPR/Cas9的编辑效率。本研究通过优化g RNA,创新了一种高效利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的方法。     

宁麦9号与扬麦158株高及其构成因素的遗传解析

宁麦9号与扬麦158是我国长江中下游麦区的主栽品种和骨干亲本,长江中下游麦区近3年来审定品种中80%都是其衍生后代,研究其性状的遗传具重要意义。以宁麦9号与扬麦158为亲本构建的包含282个家系的重组自交系群体为材料,利用Illumina 90k芯片对群体进行基因型分析,建立高密度遗传图谱。连续3个生长季对株高及节间长度、穗长等株高构成因素进行测定,结合遗传图谱对株高及相关性状进行QTL定位,获得14个控制株高及其构成因素的稳定表达位点。通过进一步位置比对,聚焦到6个染色体区段,初步明确了各节间对株高的遗传调控机制。同时,将6个染色体区段中同源性较低的连锁标记转化为适用于高通量筛选的KASP标记,利用101份区域试验材料进行标记效应验证,结果显示聚合Qph-2D与Qph-5A.1两个位点具有较高的选择效率,继续聚合Q2A后,中选材料显著减少,可能降低选择效率;对Q2A与Q5A两个一因多效位点的选择建议以降低株高的等位变异为主;Qd1-5D可作为穗下节间(D1)的选择标记对株高展开优化选择。期望以上结果能为长江中下游麦区的小麦株高遗传改良提供帮助。     

2010-2011年河南省部分地区H9亚型禽流感、新城疫

为了解河南省H9亚型禽流感、新城疫和鸡传染性支气管炎的流行情况。从河南省15个地市发病鸡场采集病鸡组织样品309份,采用鸡胚尿囊腔传代接种法分离病毒,并利用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)和RT-PCR试验对分离毒株进行鉴定。结果表明,3类病毒的总检出率为26.54%,其中NDV、IBV和AIV(H9)的检出率分别为11.00％、3.88％和11.65％。2010年10月NDV和IBV检出率均最高,分别为30.00％、15.00％,2011年1月AIV(H9)检出率最高,为43.24％。2类病毒混合感染的检出率达3.24％。表明2010年7月-2011年4月H9亚型禽流感、新城疫以及鸡传染性支气管炎在河南省部分地区普遍流行,且存在一定程度的混合感染。为有效预防和控制河南省3种主要疫病提供了科学依据。     

黑花生“中花9号”的施肥效应研究

在露地栽培条件下,设置5个复合肥施用量处理,探讨使用万植牌有机无机复合肥(N-P-K=15-15-15)栽培黑花生中花9号的适宜施肥量。结果表明:三峡库区采用万植牌有机无机复合肥露地栽培中花9号的适宜施肥量为40kg/667m~2,荚果产量可达249.5 kg/667m~2,饱果产量218.0 kg/667m~2,籽仁产量170.3 kg/667m~2,饱满籽仁产量可达126.6 kg/667m~2。     

CRISPER/Cas9系统在植物基因组定点修饰及作物遗传育种中的应用研究进展

CRISPR/Cas9系统是一项简单、高效的基因定点编辑技术,在植物遗传改良及作物良种选育等方面具有重要的应用价值。本研究主要介绍了CRISPR/Cas9的原理及构建方法,论述了近年来CRISPR/Cas9技术在植物基因功能及基因表达调控、植物基因组的定向编辑以及作物分子育种中的应用及研究进展,分析了该基因编辑系统的主要影响因素及优化改进方式,探讨了该系统在应用中的问题及解决途径并对今后发展方向进行了展望,为该技术在植物基因组定点编辑及作物遗传育种等领域研究提供参考。     

草地贪夜蛾Sf9细胞对饥饿诱导自噬的响应

为研究草地贪夜蛾对饥饿诱导自噬的响应。从草地贪夜蛾EST数据库中筛选到一段核苷酸序列,设计特异性引物,RT-PCR技术从草地贪夜蛾Sf9细胞中扩增该核苷酸序列,经过生物信息学分析该序列与昆虫自噬相关基因ATG8同源性最高,命名为SfATG8基因,并构建了pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8载体转染Sf9细胞。Sf9细胞经饥饿(PBS)诱导4 h后,Lyso-Tracker染色、Western Blotting、共聚焦显微镜检测细胞对自噬的响应程度。结果表明,经饥饿(PBS)诱导4 h的Sf9细胞中出现Sf Atg8-PE的表达,共聚焦显微镜检测到Sf9细胞膜上的自噬小体。以上证据证实饥饿(PBS)能诱导Sf9细胞发生自噬,为深入研究Sf9细胞对自噬的响应奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsCOL9水稻突变体

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。     

青虾泛素特异性蛋白酶9基因Usp9全长cDNA序列的克隆及表达分析

本研究首次克隆了青虾的Usp9 (ubiquitin-specific protease 9)基因全长 cDNA序列,并在青虾中使用荧光定量 PCR 技术首次检测了 Usp9 基因在不同组织和发育阶段中的表达变化。青虾 Usp9 基因cDNA全长 1259 bp,包括 162 bp的 5’ UTR, 978 bp的开放阅读框以及 116 bp的 3’ UTR。氨基酸序列比对分析显示,青虾 Usp9蛋白与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、凤仙花熊蜂(Bombus impatiens)及灰短尾负鼠(Monodelphis domestica)的蛋白相似度分别为 99%、 97%和 95%。应用 MEGA5.1软件对青虾与其他物种的 Usp9氨基酸进行系统进化树分析,结果表明,青虾 Usp9与同为甲壳纲的钩额型蚤状溞聚为一支,具有最近的亲缘关系。采用荧光定量 PCR技术检测了 Usp9基因的时空表达,水温 28℃时, Usp9基因在青虾发育的后幼体发育期第 5天 PL5出现表达高峰。Usp9基因在 6种成体组织中均有表达,表达水平依次为：脑＞腹神经＞精巢＞卵巢＞肌肉＞肠。而在雌雄组织差异表达分析表明,精巢中Usp9基因表达量比卵巢的比值为 2.86,脑组织中雄虾的表达量比雌虾为 2.27,差异均为极其显著(P＜0.01)。这表明Usp9基因的表达和雄性偏向基因趋势是一致的（雄性表达：雌性表达≥1.5）。本研究为进一步开展青虾Usp9基因功能等相关研究奠定了基础,并可为青虾性别的遗传调控机制研究提供参考。     

施氮量对超级稻‘松粳9号’产量及氮肥利用率的影响

为了探讨施氮量与‘松粳9号’干物质积累、产量、氮肥利用率之间的关系,明确最佳氮肥施用量,使其在生产中真正发挥超级稻的增产潜力。以超级稻‘松粳9号’为材料,通过田间小区对比试验,研究了不同氮肥施用量对超级稻‘松粳9号’产量及氮肥利用率的影响。结果表明,在水稻齐穗期,地上部植株干物质积累量和吸氮量都随着施氮量的增加而增加;成熟期地上部植株干物质积累量和吸氮量都随着施氮量的增加出现先增后减的趋势。氮肥利用率随着施氮量的增加而降低。随着施氮量的增加产量出现先增后减的趋势。产量与成熟期稻穗和植株干物重、齐穗期稻穗含氮量、成熟期稻穗和植株含氮量呈极显著正相关,与氮肥生理利用率呈显著正相关。施氮量195 kg/hm²能实现超级稻‘松粳9号’最高产量。     

紫茎泽兰脱毒工艺及其腐熟肥料在香葱上的应用研究

为了确定紫茎泽兰溶剂脱毒的最佳工艺条件及探索紫茎泽兰中泽兰酮含量与香葱产量的关系。采用正交试验与高效液相色谱法,结合堆肥发酵及相关分离分析技术。通过比较紫茎泽兰溶剂脱毒前后毒性成分含量的变化,确定了紫茎泽兰溶剂脱毒的最佳工艺条件为：pH为8、浸泡处理时间48 h、料液质量比为1:10、温度为50℃。同时分析了9-羰基-10,11-去氢泽兰酮的含量与香葱产量的关系,结果表明腐熟后的紫茎泽兰有机肥中毒素含量很低,对香葱的产量无明显影响。紫茎泽兰溶剂脱毒效果明显,其溶剂脱毒工艺应用于发酵生产有机肥具有广阔的应用前景。