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简单序列重复(Simple sequence repeats, SSR)在茶树遗传与育种研究中具有重要的作用,基于4300 DNA分析系统的SSR发掘具有通量高、准确和灵敏等特点,已被用于许多物种的分子标记研究,但在茶树的相关研究中尚未见报道。本研究应用单因素试验和L9(34)正交设计试验对影响茶树SSR-PCR的主要参数进行优化,建立了适合于4300 DNA分析系统的茶树SSR-PCR反应体系:1.0 μL DNA(25 ng·μL-1),0.2 μL M13F-F、0.2 μL R和0.4 μL IR-M13F,0.8 μL dNTPs(25 mmol·L-1),1.0 μL 10×Buffer(含Mg2+),0.1 μL Ex-Taq聚合酶(5 U·μL-1),无菌水定容至10 μL。所有引物浓度均为1 μmol·L-1。同时,本研究还证明,可以以自行配制的6.5%聚丙烯酰胺凝胶溶液(acry:bis=29:1)替代4300 DNA分析系统指定凝胶溶液,检测SSR位点。 相似文献
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香菇SSR—PCR技术体系的优化及其在遗传多样性分析中的初步应用 总被引:3,自引:2,他引:1
为建立稳定的香菇SSR技术体系,采用L16(45)正交试验设计,对影响香菇SSR-PCR的主要因素进行了优化筛选,建立了最佳的反应体系.在20μl反应体系中,包含1.5 mmol/L Mg2+,75 ng模板DNA,0.25 mmol/L dNTPs.0.50 μmoI/L引物及1.5U Taq酶.梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为62℃.以该体系为基础,应用5对引物扩增8个香菇菌株的基因组DNA,扩增条带清晰稳定,聚类分析结果能较好地反映供试菌株的地理来源关系.以0.5的相似性为分割点,8个菌株可分成2大类群.类群Ⅰ主要由北方菌株组成,类群Ⅱ由南方菌株组成.该研究为SSR标记技术在香菇分子生物学研究方面的应用奠定了基础. 相似文献
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目的 建立刨花润楠SSR-PCR最佳反应体系,从樟科树种SSR引物中筛选多态性高的引物,并对刨花润楠遗传多样性进行分析。 方法 对影响PCR反应体系的5个因素设置7个水平,利用正交设计L16(45)进行优化,确定最佳体系,并用该体系从187对候选引物中进行引物筛选。利用软件POPGENE1.32、PowerMarkerv3.25、FSTAT、GenAlex6.5、Structure2.3和POPTREE分别计算观测等位基因数目(Na)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态性信息量(PIC)、基因流(Nm),进行群体遗传结构分析和UPGMA法聚类分析。 结果 刨花润楠最佳体系(20 μL)为:Taq酶1.0 U、dNTPs 0.25 mmol·L-1、Mg2+ 1.25 mmol·L-1、引物0.5 μmol·L-1、模板50 ng。最终筛选出12对具有多态性高的SSR引物。Na、Ho、He和PIC的平均值分别为15.083、0.576、0.751和0.722,表明种群具有较丰富的遗传多样性;Nm平均值为1.500,种群间存在频繁的基因交流;UPGMA将24个种源聚为3类,与Structure分析结果一致。 结论 本研究成功优化了刨花润楠SSR-PCR反应体系,并获得12对适用于刨花润楠的SSR引物,刨花润楠种群遗传多样性丰富,种群间存在频繁的基因交流,24个种源可聚为3类。 相似文献
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柱花草(Stylosanthes)是优良的豆科牧草, 叶片中含有大量的多糖多酚, 本研究利用改良CTAB法抽提柱花草叶片中总DNA。通过正交试验设计L16(45), 确立了柱花草SSR-PCR最佳反应体系:20 μL体系中1 μL 50 ng·μL-1模板DNA, 1.6 μL 5 μmol·L-1引物, 1.6 μL 10 mol·L-1dNTPs, 1.2 μL 25 mol·L-1 Mg2+, 0.3 μL 5 U·μL-1Taq聚合酶, 2 μL 10×PCR Buffer(Mg2+ free), 剩余用ddH2O补足。扩增反应程序为94 ℃变性40 s, Tm(不同退火温度)退火时间40 s, 72 ℃延伸45 s, 循环数35个。利用优化体系对来自7种柱花草的123对SSR引物在8个不同种柱花草中进行转移, 共筛选出44对引物在8种柱花草中都能有效扩增, 并从中筛选出26对在8个不同种柱花草中富含多态性引物, 为今后利用SSR标记对柱花草属的指纹图谱构建、遗传多样性分析、分子育种和品种鉴定与保护等工作提供重要依据。 相似文献
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杉木SSR-PCR体系优化 总被引:1,自引:0,他引:1
SSR-PCR反应体系优化是杉木SSR标记研究的基础.利用正交L16 (45)设计实验对杉木SSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA浓度5个因素的4个水平进行优化试验.并在正交直观分析和方差分析的基础上,分别对Mg2+、dNTPs进行单因素确定.获得的最佳反应体系为:在20 μL反应体系中,Mg2浓度为1.0mmol/L,引物浓度为0.25 μμmol/L,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,Taq酶为0.05 U/μL,DNA为30 ng,10×PCR Buffer 2μL,不足部分用双蒸水补齐至20μL.在最佳反应体系的基础上,采用单因素实验确定了引物的最佳退火范围为63~53℃.利用此反应体系对10个F1代杉木材料及其亲本,进行4对SSR标记进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定.说明此体系适合进一步的杉木SSR研究工作. 相似文献
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[目的]借鉴以往楝属文献报道的SSR引物,筛选高度多态性、稳定性高、重复性好的苦楝SSR引物,为苦楝遗传图谱构建、QTL定位和分子标记辅助选择育种等研究领域应用奠定基础.[方法]本研究采用单因素法和正交试验设计进行SSR-PCR反应体系优化,并利用该体系以8个不同种源的苦楝基因组DNA为模板,从135对候选SSR引物中进行引物筛选.[结果]苦楝SSR-PCR最优反应体系为:1.0 μL 50 ng·μL-1模板DNA,1.2 μL 100 μmol·L-1引物,1.0 μL 10 mmol·L-1 dNTPs,0.8 μL 25 mmol·L-1 Mg2+,0.15 μL 5 U·μL-1 Taq酶,1.5 μL 10×Buffer,补ddH2O至15 μL;最终筛选出15对具有高度多态性、稳定性高、重复性好的SSR引物.[结论]本研究成功优化了苦楝SSR-PCR反应体系,并成功筛选出15对适用于苦楝的SSR引物. 相似文献
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以广西莪术(Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang)嫩叶为材料,采用单因素和正交试验设计建立和优化SSR-PCR反应体系和反应程序,对最适宜退火温度(Tm)进行筛选优化,对17对已公布的姜黄属通用性引物进行扩增试验,筛选出多态性好、条带清晰的引物。结果表明,建立了适合广西莪术SSR分析的反应体系和扩增程序,即在15μL体系中,DNA模板为30 ng/μL,3μL,Mix(包含DNTP、Mg2+、1×buffer、Taq酶)为5μL,dd H2O为6μL,引物为各0.5μL时,分析效果较好,扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性30 s,根据不同引物的退火温度复性30 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;最后72℃延伸5 min;反应结束后,4℃保存。同时筛选出在试验材料中能产生较清晰主带的引物共12对,初步验证了应用SSR分子标记分析在广西莪术遗传多样性的可行性。 相似文献
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Optimizing SSR-PCR system of Panax ginseng by orthogonal design 总被引:1,自引:0,他引:1
An orthogonal design was used to optimize SSR-PCR amplification system using Panax ginseng genomic DNA as template. Four levels of five factors (DNA template, Taq DNA polymerase, Mg^2+, primer, and dNTP) and annealing temperature have been tested separately in this system. The results demonstrated the reaction efficiency was affected by these factors. Based on the results, a stable, productive and reproducible PCR system and cycling program for amplifying a ginseng SSR locus were obtained: 20 μL system containing 1.0 U Taq DNA polymerase, 2.0 mmol·L^-1 Mg^2+, 0.2 mmol·L^-1 dNTPs, 0.3 μmol·L^-1 SSR primer, 60 ng· μla^-1 DNA template, performed with a program of 94℃ for 5 min, 94℃ for 30 s, annealing at 56.3℃ for 30 s, 72℃ for 1 min, 37 cycles, finishing at 72℃ for 7 min, and storing at 4℃. 相似文献
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二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选 总被引:1,自引:1,他引:0
为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。 相似文献
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割手密(S.spontanuem L.)SSR-PCR反应体系的优化 总被引:1,自引:0,他引:1
以广西割手密(S.spontanuem L.)79-9为材料,利用SDS法提取基因组DNA,采用正交试验设计优化建立了一套适用于割手密的SSR-PCR反应体系,即在25μL反应体系中包含10×PCR Buffer(Mg2+free)、模板DNA30 ng、Mg2+2.5 mmol/L、dNTP 0.24 μmol/L、引物0.6μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U.运用该体系对其它4份割手密进行了检验,扩增带型清晰,证明该体系稳定可靠. 相似文献