Construction of mouse ESC line stably expressing Pdx1 by Tet-On system

AIM To construct the mouse embryonic stem cell （ESC） line with stable pancreatic and duodenal homeobox 1 （Pdx1） expression by Tet-On system, which may lay a foundation for further research on the differentiation of Pdx1⁺ definitive endoderm cells into pancreatic cells. METHODS The Pdx1-overexpressing lentiviral vector with green fluorescent protein marker and puromycin resistance was constructed by Tet-On system and was used to infect the mouse ESC. The cells were divided into 3 groups： blank control group （ESC group）, empty lentivirus control group （PDX1^- ESC group） and Pdx1 lentivirus transfection group （PDX1⁺ ESC group）. Flow cytometry was used to detect the transfected cells after screening by doxycycline （DOX）. The function of Tet-On system and the expression of Pdx1 gene were detected. The transfected cells in PDX1^- ESC group and PDX1⁺ ESC group were sorted by flow cytometry, and constructed ESC line with stable expression of Pdx1 and negative control ESC line were verified. RESULTS （1） The positive rates of transfected cells in PDX1^- ESC group and PDX1⁺ ESC group were 90.72% and 94.01% after screening by DOX, respectively. The positive rates of transfected cells in PDX1^- ESC group and PDX1⁺ ESC group was 97.84% and 98.13% after sorting by flow cytometry, respectively. （2） With DOX, green fluorescence was observed in PDX1^- ESC group and PDX1⁺ ESC group. The mRNA and protein expression of Pdx1 was significantly increased in PDX1⁺ ESC group （P<0.05）. Without DOX, no green fluorescence was observed in the cells of the 3 groups, and no significant difference in the mRNA and protein expression of Pdx1 was observed （P>0.05）. （3） After 3 months of cryopreservation, the cell lines still survived in resuscitation culture and were regulated by DOX. CONCLUSION Using Tet-On system, the mouse ESC line with inducible Pdx1 expression were successfully established and could be used as an effective cell model to research the differentiation of Pdx1⁺ definitive endoderm cells into pancreatic cells.     

产低温脂肪酶假单胞菌的选育及产酶条件的优化

从取自华中农业大学的土样和长江流域及桂林桃花江水样中筛选到一株产低温脂肪酶的适冷菌,初步鉴定为假单胞菌,命名为Pseudomonas sp.YT34-8.对其产酶条件进行优化,得到其最佳发酵条件为:玉米浆2.00%,豆饼粉2.50%,蔗糖1.00%,橄榄油0.57%,MgSO4·7H2O0.05%,K2HPO4 0.10%,发酵温度8℃,初始pH值7.0,发酵时间48 h,250 mL摇瓶装液量21 mL;摇瓶转速182 r·min-1.在此条件下,其发酵酶活力可达到7.833 U·mL-1.对其所产低温脂肪酶进行初步研究,其最适作用pH值为8.0,最适作用温度为30℃,在pH值5.0～10.0范围内、40℃以下酶活力较稳定.     

文冠果叶总皂苷的提取工艺优化及减肥降脂功效

【目的】优化文冠果叶总皂苷的提取工艺,并对其减肥降脂功效进行分析。【方法】采用单因素试验并结合Box-Behnken响应面法,对文冠果叶总皂苷的提取温度、液(mL)料(g)比、乙醇体积分数进行优化。采用高脂饲料喂养小鼠建立高血脂症模型,建模4周后,以奥利司他为阳性对照,分别采用高（200 mg/kg）、中（100 mg/kg）、低（50 mg/kg）剂量组文冠果叶总皂苷连续灌胃4周,检测小鼠血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）的浓度,分析不同剂量文冠果叶总皂苷对小鼠体内胰脂肪酶的抑制作用。【结果】文冠果叶总皂苷的最佳提取工艺条件为：提取温度60 ℃,乙醇体积分数70%,液(mL)料(g)比30∶1,此时文冠果叶总皂苷得率为4.952%。对小鼠的减肥降脂试验表明,文冠果叶总皂苷对胰脂肪酶的抑制活力最高可达68.29%,且在高血脂模型中,高、中、低剂量文冠果叶总皂苷均可显著或极显著降低血清中的TC、TG、LDL-C浓度,提高HDL-C浓度,其中高剂量组的降脂作用与阳性对照药物奥利司他效果相当。【结论】文冠果叶总皂苷减肥降脂功效显著,能够有效抑制胰脂肪酶活力,降低胆固醇和甘油三酯含量,进而促进脂肪代谢。     

固定化酶催化酯交换反应制备生物柴油研究进展

介绍了脂肪酶催化酯交换反应的机理及其固定化技术,综述了固定化酶催化制备生物柴油的研究进展。     

长薄鳅幼鱼消化道指数和消化酶活性研究

测定了长薄鳅(Leptobotia elongate Bleeker)幼鱼(8.0～110.1 g)的消化道指数和不同体重组(10 g、30 g、50 g)幼鱼的胃、肝胰脏、前肠、中肠、后肠的淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶及脂肪酶活性。结果:(1)长薄鳅幼鱼肝指数平均为(1.400±0.004)%,比肠长平均为(0.418±0.080),体重与体长呈幂函数相关,相关式为:W=0.019L2.818 1(R2=0.948,P<0.01,n=43);鱼体肥满度在30 g组中最高。(2)各部位消化酶活性均以蛋白酶>脂肪酶>淀粉酶;各体重组淀粉酶活性在肝胰脏中最高(P<0.05);蛋白酶活性在胃和中肠中较高;脂肪酶活性沿消化道从前至后升高;(3)各部位淀粉酶活性在各体重组间变化不大,胃蛋白酶、肠段胰蛋白酶和脂肪酶活性随体重增加而下降。本研究认为长薄鳅幼鱼为杂食、偏肉食性,其消化酶活性存在组织特异性,体重30 g左右是其营养需求转变或者生长发育的重要时期。     

甘露糖—小清蛋白美拉德反应产物的免疫活性

为探讨以甘露糖为还原糖进行美拉德反应对小清蛋白免疫活性的影响,通过将鲢重组小清蛋白(r PV)和甘露糖混合物在干热条件下(100°C)反应100 min制得糖化的r PV(Mr PV),采用Tricine-SDS-PAGE和斑点杂交(Dot-blotting)分析糖化前后r PV的聚合特性、免疫活性及消化稳定性的变化;采用圆二色谱仪和扫描电子显微镜分析糖化对r PV的二级结构及微观结构的影响。结果显示,r PV糖化后形成大分子量的片状聚集体;甘露糖糖化修饰的r PV免疫活性及消化稳定性均显著下降;美拉德反应导致r PV二级结构中的α-螺旋和无规则卷曲的含量有一定程度的减少,而β-折叠的含量显著增加。研究表明,以甘露糖为还原糖进行美拉德反应可有效降低r PV的免疫活性及消化稳定性,这可能与糖化后r PV聚集体的形成及二级结构的改变有关。     

奥尼罗非鱼淀粉酶、脂肪酶的分布与特性

以奥尼罗非鱼(Oreochromisniloticus×O.aureus)为实验材料,研究其淀粉酶、脂肪酶分布与特性。结果表明,Ⅰ(体重55.14g)、Ⅱ(体重122.82g)、Ⅲ(体重225.68g)组实验鱼肠道淀粉酶、脂肪酶活性均表现出相似规律:活性从大到小依次为前肠、中肠、后肠。实验鱼体重从55g增至122g,肠道淀粉酶活性急剧上升,实验鱼体重从122g增至225g,酶活性增幅减缓。3组实验鱼肠道各肠段淀粉酶活性相对比值(前肠、中肠、后肠)分别为1:0.95:0.52、1:0.44:0.21和1:0.50:0.24;脂肪酶活性相对比值(前肠、中肠、后肠)分别为1:0.17:0.12、1:0.34:0.14和1:0.98:0.64。3组实验鱼淀粉酶活性相对比值(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)在全肠、肝胰脏中分别为1:8.25:18.94和1:3.43:9.31;3组实验鱼脂肪酶活性相对比值(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)在全肠中为1:3.82:13.09。奥尼罗非鱼肠道、肝胰脏淀粉酶最适pH值分别为6.5～7 0和7.5;最适反应温度均为30℃;最适反应底物浓度均为0.8%。肠道脂肪酶最适pH值为7.0～7.5,最适反应温度为35℃。     

不同生长阶段兰州鲇消化酶活性的比较研究

测定了不同生长阶段兰州鲇(Silurus lanzhotaensis)胃、肝胰脏、前肠、中肠、后肠的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性.结果表明,兰州鲇蛋白酶活性大小为:前肠>中肠>后肠>肝胰脏>胃,阶段1[体重(51.9±6.0)g]>阶段2[体重(228.6±16.6)g]>阶段3[体重(448.9±26.5)g],且差异显著;淀粉酶活性:肝胰脏>胃>前肠>中肠>后肠,阶段1>阶段2>阶段3,差算显著;脂肪酶活性大小为:后肠>中肠>前肠>肝胰脏>胃,但各阶段差异不显著.随着年龄的增长,兰州鲇对蛋白质和碳水化合物的消化能力逐渐减弱.     

罗非鱼鱼皮提取明胶的酶法脱脂工艺研究

用脂肪酶对罗非鱼鱼皮进行酶法脱脂工艺研究。通过单因素与正交试验确定最适的酶法脱脂工艺为:pH值9,脱脂时间3h,酶添加量2%,料液比1:4,温度40℃,该工艺的脱脂率可达67.5%。通过超声波辅助脱脂研究表明其脱脂率并无明显的提高。     

大黄鱼发育进程中消化酶的活力变化

不同发育阶段大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品体重30～500g,取自厦门海区网箱养殖区。以酶学分析方法测定大黄鱼发育进程中胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶4种消化酶的活力。结果表明,在大黄鱼发育进程中,对蛋白的整体消化能力始终较强;4种消化酶活力表现出2种变化模式,其中胃蛋白酶和类胰蛋白酶活力逐渐降低,而淀粉酶和脂肪酶活力呈上升趋势。胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的比活力随鱼体重的变化分别遵循回归方程Y=34．89／X 0．050;Y=53．36／X 0．29;Y=-22．38／X 1．13和Y=-1．35／X 0．13。初步认为,在大黄鱼发育过程中,150g体重为其生长发育的转折点,这一阶段各种消化酶的变化可反映其食性的变化情况,本研究旨为大黄鱼配合饲料的研制与开发提供基础依据。