家畜主要组织相容性复合体的分型方法研究

生物体免疫应答的遗传学基础及其基因调控主要涉及免疫球蛋白、T细胞抗原受体和主要组织相容性复合体(maljor histocompatibility，MHC)3个基因系统。前两者是在个体内的细胞和分子水平呈现其多样性，而MHC则是在群体内的个体水平显示其多态性，在区别同一种群内不同个体免疫应答能力和疾病易感性等差异方面，3个基因系统中的MHC起主导作用，因而MHC是近年来免疫遗传学中最为活跃的领域。     

狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外区真核表达载体的构建及其在DK细胞中的表达

为了研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)糖蛋白(rgp)膜外区在以糖蛋白为免疫原的免疫应答中的作用,提取RV的RNA,通过RT-PCR扩增RV糖蛋白膜外区1375 bp的序列,将其克隆入pMD18-T载体中,经测序比对正确后,通过酶切将其亚克隆入pVAX1表达载体的多克隆酶切位点处,将酶切鉴定正确的阳性重组子命名为pVAX-rgp,构建表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区的真核表达载体,在质脂体介导下转染DK细胞观察其表达情况。研究结果表明,经免疫荧光和Western blotting鉴定,有特异性荧光和60 ku条带产生,证明pVAX-rgp载体中的rgp可在DK细胞中表达。本研究通过成功构建狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外区的真核表达载体,为下一步有关功能基因组的研究和基因疫苗的研制奠定了基础。     

狂犬病病毒ERA株糖蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的狂犬病病毒G基因序列,设计合成了1对特异性引物,对RV ERA株G基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pMD18-T连接得到重组质粒pMD-G,并进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1 575bp,编码524个氨基酸。与GenBank中已发表的其他RV标准毒株(CVS,PV,SRV9,SAD-B19)相比,G基因核苷酸的同源性为89.1%～99.1%,推导的氨基酸序列的同源性为89.7%～99.3%。对推导的RV ERA株G蛋白氨基酸序列分析表明,该蛋白含有3个潜在的N-联糖基化位点。用DNAStar软件对RV ERA株与CVS、SRV9、PV、SAD-B19等G蛋白疏水性、Jame-son-Wolf抗原表位和表面极性分析表明,它们之间非常相似。     

狂犬病病毒糖蛋白生物学功能研究进展

狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus,RABV）感染中枢神经系统引起的致死性人畜共患传染病。RABV糖蛋白存在于病毒表面,它既是病毒的主要保护性抗原,诱导体液免疫产生中和抗体和刺激T细胞产生细胞免疫,又是病毒与细胞受体结合的结构,在病毒致病性和嗜神经性中发挥重要作用,与病毒毒力直接相关。作者归纳总结国内外RABV糖蛋白结构与功能研究进展,并对糖蛋白中和抗体的检测与评价进行阐述。将为进一步揭示RABV糖蛋白生物学功能奠定基础,为糖蛋白中和抗体的诊断提供理论参考,为控制和消灭狂犬病做出相应贡献。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达

以Ⅱ亚单纯疱疹毒-2333株(HSV-2)的基因组DNA为模板扩增编码HSV-2糖蛋白D(glyco-protein D)基因,与载体pFastBacⅠ连接,转化E.coilDH5α感受态细胞,经PCR及测序鉴定正确。将pFastBacⅠ-gD重组质粒转座至DH10Bac获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白,经对表达条件进行优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功表达HSV-2 gD蛋白,为下一步的工作奠定了基础。     

益生乳酸菌Lactobacillus plantarum P-8在规模化养殖中对肉鸡生产性能和鸡肉中盐酸林可霉素残留的影响

以益生乳酸菌植物乳杆菌P-8饲喂肉鸡,研究其在规模化养殖中对肉鸡生产性能、粪便p H及吲哚和粪臭素含量、抗生素盐酸林可霉素残留的影响。选择18万只1日龄AA肉鸡为研究对象,随机平均分为3组,对照组为基础日粮+盐酸林可霉素(3 g/t);试验组1为基础日粮+植物乳杆菌P-8+盐酸林可霉素(3 g/t);试验组2为基础日粮+植物乳杆菌P-8+盐酸林可霉素(1.5 g/t)。试验结果表明:试验组肉鸡成活率、出栏重和饮水量显著高于对照组(P0.05),料重比显著低于对照组(P0.05),试验组间无显著差异(P0.05);试验组肉鸡粪便p H、吲哚和粪臭素含量显著低于对照组(P0.05),试验组间无显著差异(P0.05);试验组鸡肉中的盐酸林可霉素含量显著低于对照组(P0.01),试验组间无显著差异(P0.05)。由此表明,植物乳杆菌P-8在大规模肉鸡养殖过程中具有减少抗生素用量、改善肉鸡生长性能和养殖环境等特点,有利于肉鸡养殖业的持续健康发展,在健康养殖领域具有广阔的应用前景。     

CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90％,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73％.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料.     

狂犬病无毒疫苗株SRV9G基因主要功能区的序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出了狂犬病无毒疫苗株（ＳＲＶ９）糖蛋白（Ｇ）基因膜外主要功能区的两个片段，共约７４０个ｂｐ（４５０￣１１４４），含有可以诱导中和抗体的两个抗原决定簇和决定毒力及与神经细胞受体结合部位的基因片段。通过平瑞连续将两片段克隆到ｐＵＣ１８的ＳｍａＩ位点。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。将这一序列与已发表的狂犬病病毒     

人及动物C群轮状病毒编码外壳糖蛋白VP7基因序列比较

测定了牛Ｓｈｉｎｔｏｋｕ和猪ＨＦ，ＷＨ株Ｃ群轮状病毒外膜糖蛋白ＶＰ７基因的核苷酸序列，并与已发表的猪Ｃｏｗｄｅｎ株和人Ｅｈｉｍｅ株的相应序列作了比较。结果发现所有５株ＶＰ７基因都有１０６３个核苷酸，有一编码３３２个氨基酸多肽的ＯＲＦ，氨基酸序列比较表明，Ｃ群轮状病毒血清型相关毒株（ＣｏｗｄｅｎＷＨ和Ｅｈｉｍｅ）间ＶＰ７有８５．２～９７．０％的同一性，而不同血清型（Ｓｈｉｎｔｏｋｕ，Ｃｏｗｅｎ，ＷＨ