外源褪黑激素对罕山白绒山羊绒毛生长相关基因表达差异的影响

试验旨在筛选罕山白绒山羊皮肤毛囊生长脱落相关的关键基因,并揭示外源褪黑激素（Melatonin,MT）对罕山白绒山羊绒毛生长相关基因表达差异的影响。选择10只体重平均为33.3 kg、年龄为20月龄的罕山白绒山为实验动物,分为2组,从2014年12月开始每隔1个月按照2 mg/（kg·BW）的剂量在埋植组绒山羊耳后皮下埋植MT,于2015年9月采集2组罕山白绒山羊皮肤组织进行RNA-Seq测序,对差异表达基因进行筛选、功能注释和富集分析。共筛选获得了475个在埋植组与对照组中差异表达的基因,其中,上调表达基因392个,下调表达基因83个。KEGG富集性分析表明,差异表达基因主要参与白细胞经内皮迁移、趋化因子信号通路、fcγ-R介导的吞噬作用、吞噬体、造血细胞谱系、补体级联和混凝级联、细胞因子—细胞因子受体相互作用、NF-kappa B信号通路、PI3K-Akt信号通路等。PI3K-Akt信号通路可能在褪黑激素调控皮肤毛囊发育中发挥重要作用。研究结果为进一步研究MT影响皮肤毛囊生长的分子机理提供依据。     

紫花苜蓿GDP解离抑制蛋白基因cDNA的克隆、分析及烟草转化

采用RT-PCR方法,克隆得到紫花苜蓿(Medicago sativa L.)GDP解离抑制蛋白基因cDNA核心区域序列,命名为MsGDI1。序列分析结果表明,该cDNA核心区域全长1575 bp,包含一个1332 bp的最大开放阅读框,编码444个氨基酸。半定量RT-PCR分析结果表明,在盐胁迫和铝胁迫条件下,MsGDI1基因的表达随着胁迫时间的增加而上升,该基因可能与紫花苜蓿抗盐耐铝机理有关。借助于新构建的该基因超表达载体,用农杆菌介导方法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。转基因烟草植株PCR检测的结果表明,MsGDI1基因已经成功插入到烟草基因组中,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体的构建及其在293细胞瞬时表达

在293细胞中瞬时表达A/Chicken/Henan/1001/2010（H9N2）NS1基因蛋白,并对表达蛋白活性进行测定。试验利用PCR技术从NS1-T载体质粒上扩增NS1基因,将其克隆至pCAGGS载体,构建重组质粒NS1-pCAGGS;经酶切和测序鉴定正确后,重组质粒NS1-pCAGGS与脂质体按照一定比例混合后转染293细胞,用间接免疫荧光方法对瞬时表达细胞进行荧光信号反应。结果显示,禽流感NS1基因可以很好地在293细胞中瞬时表达,具有良好的反应原性。     

冷刺激下AA肉鸡FBP1基因表达量的研究

为了解冷刺激条件下果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)基因在肉鸡组织中的表达情况,试验选择75只AA肉鸡随机分成了对照组(正常饲养温度)和4个处理组(比正常饲养温度低3 ℃),从雏鸡8日龄开始每天分别进行1、3、5和24 h的冷刺激,在21日龄时结束冷刺激,并于22日龄屠宰测定FBP1基因在AA肉鸡各组织中的表达情况。结果表明,在冷刺激条件下,FBP1基因表达量存在组织特异性,在1 h处理组中FBP1基因在肝脏中的表达量显著高于其他各组织(P< 0.05),在3 h处理组中FBP1基因在肺脏中表达量显著高于除肝脏外的其他各组织(P< 0.05),在5 h处理组中FBP1基因在肝脏中的表达量显著高于其他各组织(P< 0.05),在24 h处理组中FBP1基因在胸腺中的表达量明显高于其他各组织(P< 0.05)。在相同组织不同处理组中,心脏FBP1基因的表达量除3 h组明显降低外,其余处理组随冷刺激时间延长呈下降趋势,肝脏中FBP1基因表达量在5 h组中显著高于其他各处理组(P< 0.05),脾脏中FBP1基因的表达量除在1 h组中明显降低外,其余各处理组随冷刺激时间延长呈下降趋势,肺脏中FBP1基因的表达量呈先上升后下降的趋势,肾脏中FBP1基因表达量除在24 h组中明显降低外,其余各组没有明显变化,胸腺中24 h组FBP1基因表达量显著高于其他处理组(P< 0.05),且其他处理组与对照组差异不显著(P >0.05)。     

二丁基羟基甲苯对雨生红球藻虾青素和油脂积累的影响

以雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为对象,研究高光照、缺氮条件下,外源添加不同浓度的二丁基羟基甲苯(Butylated hydroxytoluene, BHT)对雨生红球藻生长、虾青素积累、油脂合成、脂肪酸组成、碳水化合物、蛋白含量以及虾青素和脂肪酸合成相关酶基因的影响。结果显示,添加不同浓度的BHT后,2 mg/L BHT添加组虾青素积累量为最高,显著高于其他实验组和对照组(P<0.05),达到31.66 mg/g,是对照组的1.87倍。油脂含量达45.56%,高于同期对照组(39.06%),脂肪酸组成变化不显著。在此条件下,虾青素合成关键酶基因dxs和bkt表达水平分别是对照组的5.19倍和2.04倍;脂肪酸合成关键酶基因kas和acp表达水平较对照组显著提高(P<0.05),分别是对照组的4.56倍和3.02倍。与对照组相比,2 mg/L BHT添加组的碳水化合物和蛋白含量均呈下降趋势。研究表明,在胁迫条件下,外源添加适量浓度的BHT能有效促进雨生红球藻中虾青素的积累,同时提高了藻细胞内的油脂含量。     

岩牡蛎正常和低盐胁迫下定量PCR内参基因的筛选与验证

实时荧光定量 PCR 已广泛用于基因表达的分析,合适的内参基因选择是获得准确分析结果的关键。本研究选用正常生理状态下岩牡蛎(Crassostrea nippona)的鳃、外套膜、闭壳肌和内脏团 4 种组织以及盐度 10、20 和 30暂养 1 周后的鳃组织为材料,对已报道的常见内参基因(EF1A、GAPDH、RO21、TUB 和 TUA)的稳定性通过 3 种方法(geNorm、NormFinder 和 BestKeeper)进行分析和筛选,发现针对鳃单一组织在不同盐度胁迫下, GAPDH 和RO21 可以作为合适内参基因,而在不同组织中,需要更多的内参基因联合分析才能获得准确的定量表达结果。本研究是首次利用 q-PCR 对岩牡蛎进行内参基因的筛选和验证,为今后该物种低盐胁迫相关的基因表达和功能基因的研究提供重要依据。     

油桐花芽RNA提取方法的改良及油桐SOC1基因片段的克隆分析

采用RNAiso-mate+改良CTAB法进行油桐花芽RNA的提取试验,用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,核酸蛋白质检测仪检测其纯度,研究提取油桐花芽高质量RNA的方法。结果表明:RNAiso-mate+改良CTAB方法提取的RNA质量好,条带清晰,亮度高,完整性及纯度较好,A260/A280比值为1.97、1.93,得率176.9、154.2μg/mL。在提取到的高质量RNA基础上,采用RT-PCR方法成功克隆了油桐SOC1基因片段,长度为611bp,含起始密码子,编码203个氨基酸;序列分析表明油桐SOC1基因与蓖麻、杨树、大豆的SOC1基因相似度分别为85%、84%、78%,进化树分析得出油桐SOC1基因与北美木兰SOC1基因亲缘关系较近。     

三疣梭子蟹14-3-3基因的克隆及其在低盐和病原胁迫后的表达分析

本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)14-3-3基因(Pt14-3-3)。Pt14-3-3基因cDNA序列全长为2510 bp,包含开放阅读框741 bp,编码由247个氨基酸组成的蛋白,分子量为27.98 kDa。序列比对结果显示,Pt14-3-3基因与中华绒螯蟹14-3-3基因同源性最高(100%)。系统进化树分析表明,Pt14-3-3氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)紧密聚为一支。组织表达分析显示,Pt14-3-3基因在肝胰腺、肌肉、鳃、心脏、眼柄、血淋巴中均有表达,其中,在肝胰腺中的表达量最高。低盐胁迫后,Pt14-3-3基因在鳃和肝胰腺中的表达量分别于48 h和12 h显著上调并达到最大值,分别为对照组的1.34倍(P<0.05)和7.54倍(P<0.05)。人工感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和白斑综合征病毒(WSSV)后,Pt14-3-3基因在肝胰腺和血细胞中整体均呈显著上调表达,最高上调17.52倍(P<0.05)。本研究结果表明,Pt14-3-3基因可能在三疣梭子蟹低盐适应和免疫反应中发挥重要作用。     

三角帆蚌外套膜表达的免疫相关基因筛选

利用三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)外套膜cDNA文库EST序列,通过BLAST分析注释基因功能,发现35个与免疫防御功能相关的基因。根据其功能,这些免疫相关基因可划分为7类,即细胞免疫过程(2个)、蛋白酶和蛋白酶调节子(9个)、压力蛋白(7个)、抗菌肽(5个)、溶酶体酶(2个)、粘着蛋白(3个)及细胞凋亡和细胞周期调控相关基因(7个)。免疫相关基因在三角帆蚌外套膜中的广泛表达表明外套膜是重要的免疫组织。该研究为三角帆蚌外套膜分子免疫机理研究和抗病育种工作提供了基础性资料。     

鲤与生长性状相关的EST-SSRs标记筛选

以大头鲤(Cyprinus pellegrini Tchang)(母本)与荷包红鲤(Cyprinus carpio wuyuanensis)抗寒品系(父本)杂交产生的F1作为亲本,以其自交F2作为分离群体,结合"拟测交"策略,用EST-SSRs标记对其中92个个体进行基因型检测.利用Windows Map Manager 2.0的标记回归法对符合拟测交分离的70个EST-SSRs标记进行单标记回归分析,检测出8个与鲤体长、体高、体厚性状相关的标记.对同一标记不同基因型个体间生长性状进行显著性比较,通过t检验,找到与生长性状相关的基因型.将上述8个EST序列与GenBank数据库进行BLAST比对,有3条EST序列与蛋白库中已知功能的序列高度同源.其中HLJE225与编码斑马鱼(J9enio rerio)冷诱导基因RNA结合蛋白的基因同源性水平高达97%,HLJE222与编码斑马鱼DAZ相关蛋白1基因同源性水平也高达97%,HLJE599与编码斑点叉尾鲴(Ictalurus punctatus)核糖体蛋白L6基因的同源水平为87%.本研究鉴定的与鲤生长性状相关的功能基因及有利用价值的基因型,为鲤重要生长性状的QTL(数量性状基闪座)定位和分子标记辅助育种提供了一定的依据.[中国水产科学,2009,16(1):15-22]