溶藻弧菌单克隆抗体的制备及应用

小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0与经溶藻弧菌(1.1587)免疫的BALB3/C雌鼠脾细胞在PEG条件下融合,有45.8%的培养孔有杂交瘤细胞生长,其培养上清液抗体阳性率为77.4%.经反复有限稀释法克隆杂交瘤细胞,获得7株抗溶藻弧菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别为AC1-C9,AC1-C11,BB4-D4,AD1-A3,AD1-F3,AD2-E7,AD2-F7.取AD1-F3扩大培养,注射小鼠,制备了抗溶藻弧菌的单克隆抗体腹水,滴度为11000.该腹水与其他3株溶藻弧菌菌株有强交叉反应,与其他13株标准菌株无交叉反应.利用制备的单抗腹水,建立了检测溶藻弧菌的单抗-ELISA技术.该反应系统可应用于溶藻弧菌的快速诊断,反应时间为6-7h,检测灵敏度为104cells·-1.并利用该检测方法进行了11份待测菌样本溶藻弧菌的检测.     

母体对小麦胚的ABA敏感性和种子休眠性的影响

种子休眠是品种穗发芽抗性的主导因素,休眠特性与母体效应和胚对ABA的敏感性均有密切关系。为了了解母体对小麦胚的ABA敏感性和种子休眠的影响,为抗穗发芽育种提供科学依据,对穗发芽抗性不同的小麦品种及它们正反交F1后代授粉后不同发育阶段的胚进行了ABA敏感性鉴定,并对收获前的籽粒发芽能力进行了测定。结果表明,在种子发育过程中,不同基因型的离体胚萌发能力存在差异,抗穗发芽品种的胚对ABA敏感性明显高于易穗发芽品种,胚对ABA的敏感性与其萌发能力关系密切,随着萌发能力的升高,胚对ABA的敏感性降低。在成熟种子中,F1的休眠性偏向于抗性亲本。尽管成熟种子和胚的休眠表现出一定的母体效应,但母体对发育至成熟过程中胚的ABA敏感性并没有影响。因而,母体对种子休眠的影响可能与胚的ABA敏感性无关。     

鸡传染性法氏囊病母源抗体对弱毒疫苗免疫效果的影响

雏鸡传染性法氏囊病 (IBD)母源抗体高低不一是造成免疫失败的主要原因 ,利用琼脂扩散试验对不同日龄的 2 76群鸡母源抗体以及免疫前后抗体的检测 ,了解鸡传染性法氏囊病母源抗体对IBD弱毒疫苗免疫效果的影响 ,从而找出最佳免疫时机     

抗李斯特菌特异单抗试剂的研制及应用

用１％福尔马林灭活单核细胞增生李斯特菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）Ｇ１９５１３０ｍｉｎ制成免疫原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，获得３株高度特异的针对单核细胞增生李斯特菌、无害李斯特菌和格氏李斯特菌的单克隆抗体，分别命名为ＬＪ１０Ａ、ＬＢ５、ＬＭ１１。选择其中１株ＬＪ１０Ａ作为包被抗体和酶标抗体，建立了快速、敏感、特异的检测该菌的单抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。该方法对单核细胞增生李斯特菌的最小检出量为５×１０５，模拟样品能检出５００ｃｆｕ／ｋｇ样品，且４０ｈ内能报告结果。通过检测２４０份肉样和８５０份奶样并与常规方法平行相比较，该方法的敏感性和特异性分别达到１００％和９６．９％。     

分泌抗BVDV McAb杂交瘤细胞株的建立

用牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）感染ＭＤＢＫ细胞,将感染细胞培养物冻融后离心取上汪经ＰＥＧ沉淀浓缩抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清抗体效价高遥免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞在ＰＥＧ作用下融合,产生杂交瘤细胞,用间接ＥＬＩＳＡ法检测杂交瘤细胞生长孔上清,筛选阳性杂交瘤细胞株。以有限稀法克隆２－３次,得到８ 泌抗ＢＶＤＶ的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株。８株ＭｃＡｂ对ＢＶＤＶ,猪瘟均呈阳性反应。杂交     

人工雌性激素己烯雌酚单克隆抗体的制备及表征

合成了己烯雌酚的半抗原CP-DES,并将半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联制备免疫原和包被原。将免疫好的Balb/c小鼠脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选出了1株能稳定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D87C412C7。分析该杂交瘤细胞的染色体,并以间接酶联免疫吸附分析法(iELISA)检测了单克隆抗体免疫球蛋白的类型。获得的杂交瘤细胞的平均染色体数目为45-50对左右,它分泌IgG1亚类的单克隆抗体。该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定,细胞上清效价大于640,诱导腹水效价大于108,该单克隆抗体的检测限IC20=2.3ng/ml,与己烯雌酚结构类似物存在一定的交叉反应,与两种载体蛋白(BSA,OVA)无交叉反应。本研究为己烯雌酚ELISA检测方法的建立提供了条件。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,获得了3株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1C7A4、4F3F5和4G8F7,其染色体平均数为98～103,间接ELISA检测3株细胞培养上清效价分别为1:3125、1:3125、1:15625,小鼠腹水效价分别为1:390000、1:390000、1:1950000.ELISA结果显示,1C7A4、4F3F5和4G87F仅与融合表达的PCV2-Cap蛋白反应,而与PET-32a载体表达的蛋白不反应.相加ELISA结果显示3株单克隆抗体对应两个不同的病毒抗原位点.间接免疫荧光结果显示,1C7A4、4F3F5和4G8F7能与PCV2发生反应,而不与PCV1发生交叉反应.结果表明所获得的3株单抗是PCV2型特异性的,为PCV1和PCV2鉴别诊断方法的建立奠定了基础.     

基于纳米材料电化学免疫传感器检测禽呼肠孤病毒研究

【目的】构建一种用于检测禽呼肠孤病毒(ARV)的新型电化学免疫传感器。【方法】将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后,加入HAuCl4溶液于80℃还原成金纳米粒子（AuNPs）,得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子(G-Chi-AuNPs)纳米复合物。将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后,先加入AgNO3溶液于80℃还原成银纳米粒子（AgNPs）,再加入禽呼肠孤病毒单克隆抗体(ARV-MAb),得到石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子-禽呼肠孤病毒单克隆抗体（G-Chi-AgNPs-ARV-MAb）纳米复合物。将G-Chi- AuNPs纳米复合物修饰金电极作为传感器平台,固定待检测样品,然后加入G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物,并对G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的孵育时间进行优化,构建了ARV电化学免疫传感器。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对禽流感（H5N1、H3N6和H9N2亚型）、新城疫病毒（NDV）、喉气管炎病毒（LTV）、传染性支气管炎病毒（IBV）和传染性法氏囊病毒(IBDV)进行检测,以确定ARV电化学免疫传感器的特异性。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对106.5-100.5 TCID50/mL的病毒进行检测,以确定ARV电化学免疫传感器的敏感性试验。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对临床样品进行检测,其确定ARV电化学免疫传感器的实用性。【结果】所建立的ARV电化学免疫传感器,G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的最佳孵育时间为40 min。当检测的样品为阳性时,ARV与ARV-MAb特异结合,G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物被固定到电极的表面使其线性伏安曲线出现AgNPs的氧化峰;当检测样品为阴性时,其线性伏安曲线不出现AgNPs的氧化峰。特异性结果表明,所建立的方法仅对ARV的检测为阳性（出现AgNPs的氧化峰）,而对非目标禽流感（H5N1、H3N6和H9N2亚型）、NDV、LTV、IBV和 IBDV的检测为阴性（不出现AgNPs的氧化峰）。敏感性结果表明,所构建的ARV电化学免疫传感器,具有很高的敏感性,对ARV检测的敏感性达101.5 TCID50/mL。使用建立的ARV电化学免疫传感器对22份临床样品进行检测,结果与病毒分离方法相符。【结论】所建立的ARV电化学免疫传感器,具有特异性强、敏感度高及快速的特点,为有效检测诊断禽呼肠孤病毒提供了一种新的快速检测诊断技术。     

三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究

[目的]探讨系统地检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的方法。[方法]通过三甲氧苄氨嘧啶与马来酸酐反应,得到三甲氧苄氨嘧啶半抗原,再通过免疫动物得到抗三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体,并将其应用于能够检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的ELISA试剂盒。[结果]试验表明,该试剂盒对水质中三甲氧苄氨嘧啶的检测限为2.34μg/kg,IC50(50%抑制浓度)为4.8μg/L,回收率为60.5%~79.7%,试剂盒的标准曲线范围为0~80μg/L,批内、批间的相对标准偏差均小于10%,三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1%,4℃下能够保存12个月,稳定性较好。[结论]研究可为监管三甲氧苄氨嘧啶的滥用提供参考。     

检测犬源狂犬病毒中和抗体ELISA方法的建立

为了有效监测犬免疫狂犬病疫苗后的保护效力,以狂犬病毒(Rabies virus,RV)糖蛋白的主要优势抗原表位区G3蛋白(RV G3)作为包被抗原,建立了一种检测狂犬病毒中和抗体效价的间接ELISA方法.通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量为8 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶3 000.特异性试验表明,该抗原不与犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复性试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶1 280.此方法检测134份血清样品的结果与美国SYNBIOTICS试剂盒相比,总符合率达95.6%.