抗菌肽Thanatin基因表达载体构建与表达

根据大肠杆菌的密码子偏好性,人工设计并合成了3条寡核苷酸片段,相邻片断有17个碱基的重叠区,通过PCR扩增得到抗菌肽Thanatin基因,将此基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,然后将重组质粒pGEX- Thanatin转化E.coli BL 21,经IPTG诱导进行融合表达.通过SDS - PAGE分析,融合蛋白GST -Thanatin 表达成功.     

草鱼肠道抗菌肽对细菌形态结构的影响及理化性质研究

通过扫描电子显微镜观察草鱼肠道抗菌肽处理后的大肠杆菌、金色葡萄球菌、嗜水气单胞菌的形态结构的变化.结果显示,经过抗菌肽处理后的细菌形态发生变化,菌体严重变形,表面变得粗糙,出现皱褶,胞膜破裂.对草鱼肠道抗菌肽的理化性质的研究结果显示,草鱼肠道抗菌肽具有很好的热稳定性,耐胰蛋白酶特性.     

重组Pen-2乳杆菌的抗感染作用及其对小鼠免疫功能的影响

[目的]在实验室成功构建了含有对虾抗菌肽基因Pen-2的重组乳杆菌L.casei 393/pen的基础上,研究重组乳杆菌L.casei 393/pen经口服小鼠后的抗感染和免疫促进作用.[方法]将昆明系小鼠和balb/c系小鼠随机分为生理盐水组、乳杆菌L.casei 393组和重组乳杆菌L.casei 393/pen组,口服灌胃小鼠.每隔7d测量小鼠体重,28 d后检测小鼠的免疫器官指数和细胞因子IL-6的浓度,并用金黄色葡萄球菌对其进行腹腔注射攻毒.[结果]灌胃28 d后,重组乳杆菌L.casei 393/pen组的体重、免疫器官指数和细胞因子IL-6浓度均明显高于其他2个试验组;用金黄色葡萄球菌攻毒后,重组乳杆菌L.casei 393/pen组的死亡率比乳杆菌L.casei 393低50％,比生理盐水组低83.3％.[结论]重组乳杆菌L.casei 393/pen经口服小鼠后,具有显著的抗金黄色葡萄球菌感染和较好的免疫促进作用.     

类风湿因子与抗环瓜氨酸肽抗体在诊断类风湿关节炎中的应用

目的通过对类风湿关节炎（RA）患者及非RA患者血清中的类风湿因子（RF）与抗环瓜氨酸肽抗体（抗-CCP抗体）水平测定,探讨抗-CCP抗体在RA的诊断价值．方法用酶联免疫吸附方法对49例RA、6l例非RA患者测定血清抗CCP抗体及RF,并对检测结果进行比较．结果49例RA患者中抗-CCP抗体阳性23例,61例非RA患者抗...     

黑木耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质研究

应用SignalP 3.0 Server软件对黑木耳漆酶基因lac1(GenBank No.AY450405)编码的蛋白质序列进行分析,发现在其N端存在18个氨基酸的信号肽序列。通过RT-PCR克隆了lac1基因,分别构建带有自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPICN-lac1和以α因子信号肽替换自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPIC9-lac。将这两个载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞,获得基因工程菌GS115-pPICN-lac1与GS115-pPIC9-lac。SDS-PAGE分析和酶活性测定结果表明,在转化后者中漆酶基因得到了有效分泌表达,而在转化前者中漆酶基因未能得到有效分泌表达。进一步研究确定GS115-pPIC9-lac菌株液体发酵的最适pH为4.0,在此发酵条件下,其分泌表达的漆酶最高酶活为0.149U·mL-1。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,在最适反应条件下其pH稳定性和热稳定性均较好。     

竹肉球内生菌多肽的分离及抑菌活性

采用浸提、离心、沉淀、冻干的方法得到竹肉球内生菌(Engleromyces goetzei P.Hennings)的粗提物,再经分子筛G-25凝胶柱纯化后得到粗多肽,采用滤纸片法和平板对峙法,以抑菌圈直径为指标进行抑菌活性检测,结果表明:粗多肽对农业致病真菌的菌丝生长均有不同程度的抑制作用,其中,内生菌多肽DMSO提取液对小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、核果炭疽病菌(Drupe anthrax)和茄子黄萎病菌(Verticilllium albo-atrum)的抑菌活性最高,IC50分别为8.70、9.48和8.96μg/mL。同时,对抗菌肽在酸碱、高温、酶解和有机溶剂环境下的稳定性进行研究,结果显示:除了具有一定的溶剂选择性及α-淀粉酶、胃蛋白酶对其有一定程度的水解之外,该抗菌肽具有很强的稳定性。用HPLC对粗多肽进一步纯化,得到电泳纯的抗菌肽。     

棉籽蛋白酶解物的制备及其抗菌活性

【目的】通过体外模拟动物胃肠道消化环境,对两种棉籽蛋白的酶解产物抗菌活性进行研究,为棉籽蛋白精深加工、高值化利用提供理论依据。【方法】以棉籽粕为原料,用Osborne法和传统的碱溶酸沉法分别制备棉籽蛋白(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白)和棉籽分离蛋白(cottonseed protein isolate,CPI),用凯氏定氮法测定所得棉籽蛋白的蛋白含量,Tricine-SDS-PAGE测定蛋白亚基组成,通过扫描电镜观察蛋白的表面微观结构,选取蛋白含量较高的球蛋白(cottonseed globulin,CPG)和CPI进行研究。通过体外模拟动物胃肠道消化环境,用胃蛋白酶和胰蛋白酶依次对CPG和CPI进行酶解;以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为受试菌,分别以抗生素卡那霉素(Kanamycin,Kan)及未经酶解的蛋白溶液为对照,研究棉籽蛋白酶解产物的抗菌活性,同时用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测酶解产物中小肽的分子量大小及分布。【结果】碱溶酸沉法的提取率为(70.52±2.40)%,所得CPI的蛋白含量为(89.53±0.66)%;用Osborne法分别得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等4种棉籽蛋白,提取率为(67.55±1.16)%,其中CPG的蛋白含量最高为(82.57±1.02)%。Tricine-SDS-PAGE图谱表明CPG的亚基组成与CPI较接近;扫描电镜观察到的蛋白表面微观结构差别较大,CPI为颗粒大小较均匀整齐的蜂窝状结构,CPG由大小不均一的蛋白颗粒构成;相对于CPI,CPG中氨基酸保留较为完全。相同加酶量处理情况下,CPI的水解度高于CPG,且棉籽分离蛋白的小分子肽段(MW≤0.8 k Da)含量(70%—85%)显著高于棉籽球蛋白(40%—60%)。抗菌活性检测结果表明,当胃蛋白酶-胰蛋白酶加酶量为5 000—5 000 U时,两种蛋白酶解产物的抗菌能力最强,此时CPI和CPG的水解度分别为(24.72±1.07)%和(19.26±0.39)%,二者酶解产物对大肠杆菌的抑制能力均高于对金黄色葡萄球菌的抑制能力;CPI酶解产物的抗菌活性比CPG高,两者未经消化的蛋白溶液均无抗菌能力。通过分子量测定结果分析得到CPI酶解产物的抗菌活性物质的分子量在0.57—0.75 k Da,而CPG分子量分布在0.66—0.78 k Da。【结论】两种方法制备的蛋白在提取率方面没有显著差异(P0.05),在亚基组成方面,Osborne法分级的蛋白间差异较大,但CPG和CPI组成较为相似;二者经体外模拟消化后的酶解产物均具有一定的抗菌活性,CPI酶解产物的抗菌活性高于CPG。     

基于胰岛-肠轴调节机制研究痛泻要方对肠易激综合征的作用机制

目的 通过观察痛泻要方对腹泻型肠易激综合征模型血清及结肠组织中胰高血糖素样肽-1（glucagon-like PePtide-1,GLP-1）、胃动素（Motilin,MTL）和生长抑素（Somatostatin,SS）含量的影响,研究胰岛-肠轴调节在腹泻型肠易激综合征中的机制及干预效果。方法 将80只清洁级SD大鼠,随机分为正常空白对照组（A组）,模型对照组（B组）、痛泻要方组（C组）、阳性药物对照组（D组）,造模成功后分组干预,与阳性药物对照组比较,观察其对模型大鼠血清及结肠组织中GLP-1、SS及MTL的含量。结果 与空白对照组比较,模型大鼠血清及结肠中GLP-1含量降低,SS及MTL含量明显增加（P<0.05）;与模型对照组比较,痛泻要方组和西药斯巴敏组均能升高血清及结肠组织GLP-1的含量,降低SS及MTL含量（P<0.05,P<0.01）。结论 痛泻要方可通过调节腹泻型肠易激综合征模型大鼠血清及结肠中GLP-1（升高）、MTL及SS含量（降低）,调节胰岛-肠轴中的代谢物质,从而起到治疗作用。     

利用噬菌体随机肽库筛选抗原模拟表位的研究进展

噬菌体随机肽库技术是将编码外源多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白结构基因的表达而表达,被展示的外源多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性,是一种基因型与表达型的统一。近年来,噬菌体随机肽库技术被广泛应用于各种抗原的模拟表位筛选中,并取得了显著成果。综述了利用噬菌体随机肽库技术在抗原模拟表位筛选中的研究进展。     

人溶菌酶定点突变基因在毕赤酵母中的表达及活性分析

利用PCR法将人溶菌酶(h LYZ)成熟肽与载体信号肽连接处的氨基酸残基进行定点突变,突变基因亚克隆至酵母分泌型表达载体p PICZαA,重组载体线性化后通过电击转化法转化巴斯德毕赤酵母X-33,利用含Zeocine抗生素的YPDS平板筛选高拷贝转化子。转化子酵母经甲醇诱导后取培养基离心上清液进行SDS-PAGE和活性检测。结果显示,突变体h LYZ活力和表达量较野生型均有显著提高。表明定向改变h LYZ信号肽残基性质可以提高其表达量和分泌效率。