Muscovy duck retinoic acid-induced gene I (MdRIG-I) functions in innate immunity against H9N2 avian influenza viruses (AIV) infections

Retinoic acid inducible gene I (RIG-I) is a cytosolic pattern recognition receptor that senses pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Muscovy duck (Cairina moschata) is a large duck different from other species of ducks, and is more susceptible to some microbial pathogens. In this study, the Muscovy duck RIG-I gene (MdRIG-I) was identified. Quantitative RT-PCR showed that MdRIG-I mRNA was widely expressed in different tissues, especially in those with mucosa. RIG-I null DF-1 cells transfected with DNA constructs encoding MdRIG-I or CARDs domain can activate IRF-3 and NF-κB to up-regulated activity of IFN-β promoter. The components of the signaling pathway downstream of RIG-I in mammalian cells including IRF-3, NF-κB, IFN-β and the IFN-stimulated genes Mx-1, PKR and MDA5 were significantly up-regulated in CARDs-overexpressing-DF-1 cells. Implicating RIG-I in the antiviral response to an infection in vivo, we found that RIG-I expression in brain, spleen, lung and bursa were up-regulated in ducks challenged with H9N2 avian influenza virus (AIV), whose six internal genes were closely related to the H7N9 and H10N8 AIV. In vitro, DF-1 cells transfected with MdRIG-I plasmid can respond significantly to H9N2 AIV, evident through enhancement of IFN-β promoter activity and decreased virus titer. Altogether, these results indicated that MdRIG-I is a novel member of RLR gene family, engaging in the early stage of antiviral innate immunity.     

重组虹鳟IFN-γ2的原核表达及抗IHNV活性分析

为获得虹鳟IFN-γ2(rt IFN-γ2)抗传染性造血器官坏死病毒(IHNV)活性的相关数据,实验根据NCBI已发表序列设计引物,提取经植物血凝素刺激后的虹鳟头肾细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增471 bp的该基因完整开放阅读框。将该基因重组至原核表达载体p ET32a中,并转化大肠杆菌Rosetta,进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示,目的蛋白以包涵体形式表达,大小约为38.4 ku。重组蛋白经复性、纯化后在CHSE-214细胞上进行抗IHNV活性分析,结果显示,rt IFN-γ2在CHSE-214细胞上抗IHNV活性为6.63×106U/mg。Real-time PCR结果显示,rt IFN-γ2免疫后,虹鳟头肾、脾、肝中IRF-1、IRF-2、IFN-I、IFN-γ和Mx表达水平均显著提高,总体而言免疫后2天机体抗病毒状态弱于免疫后1天。攻毒保护实验结果显示,免疫后1天进行IHNV攻击时,鱼死亡率为40%,而免疫后2天进行IHNV攻击时,鱼死亡率达到80%。研究表明,原核表达系统制备的重组虹鳟IFN-γ2不仅具有体外抗IHNV活性,更能激发虹鳟的抗病毒状态,从而为虹鳟抵抗IHNV感染提供一定的保护力。     

传染性造血器官坏死病毒微型基因组表达干扰素对病毒的抑制效应

为构建传染性造血器官坏死病毒(IHNV HLJ-09)微型基因组并表达虹鳟IFN,采用RT-PCR扩增IHNV HLJ-09株的N、P、L、G和NV蛋白基因并亚克隆入真核表达载体pCI中,构建辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV;将扩增获得的IHNV基因组两末端序列、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因、虹鳟I型干扰素(IFN)基因克隆到真核表达载体pCI中构建出表达EGFP的IHNV微型基因组pCI-LFGT和表达IFN的IHNV微型基因组pCI-LFIT;将pCI-LFIT质粒转染已接种IHNV HLJ-09毒株的EPC细胞,实时荧光定量PCR法测定细胞中IHNV G基因RNA。结果显示:构建的微型基因组不论与辅助病毒还是与5个辅助质粒共转染,外源基因均能正确表达;pCI-LFIT质粒转染已接种病毒的EPC细胞组与对照组相比其中的病毒核酸显著减少。     

复方苦芩多糖对细小病毒病犬外周血IL-4及IFN-γ表达的影响

为了探讨复方苦芩总多糖(KQPC)对细小病毒病犬的免疫功能的影响,将KQPC制成针剂,犬细小病毒攻毒;将健康犬随机分成空白组、阳性组、攻毒组、复方苦芩组及3种浓度的KQPC组;给药7 d后攻毒,ELISA法检测外周血IL-4、IFN-γ含量,分离外周血淋巴细胞提取总RNA,RT-PCR法测定IL-4、IFN-γ表达水平。结果与攻毒组相比,复方苦芩、KQPC均能降低IL-4含量及其mRNA表达,提高IFN-γ含量及其mRNA表达(P<0.01)。表明KQPC能调节细小病毒病犬免疫功能,可能是复方苦芩的主要作用成分之一。     

鸡γ-干扰素联合新城疫活疫苗对肉鸡免疫效果的研究

选用350只1日龄罗氏308商品肉鸡,比较不同剂量的鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)在新城疫活疫苗免疫前、后使用以及与疫苗同时使用对淋巴细胞刺激指数、巨噬细胞吞噬指数以及鸡新城疫HI抗体滴度的影响。结果显示:各试验组淋巴细胞刺激指数(SI)均高于空白对照组,表现差异显著(p<0.05);与疫苗对照组相比,疫苗免疫后给药组SI优于免疫前给药组和同时给药组,其中两次免疫后给药组好于一次免疫后给药组,500IU/羽的使用剂量优于100IU/羽;ChIFN-γ在免疫的不同时期使用均能有效提高巨噬细胞吞噬指数;两次免疫后给药组较疫苗对照组能明显提高28日龄以后新城疫抗体滴度,表现差异显著(P<0.05);一次免疫后给药组和免疫前给药各组的新城疫抗体滴度及变化趋势与疫苗对照组接近;但同时给药组各日龄段的新城疫抗体滴度都明显低于疫苗对照组。本试验结果显示ChIFN-γ联合新城疫活疫苗使用有助于提高疫苗免疫效果,其使用最佳时机为新城疫活疫苗免疫后使用,使用剂量为500IU/羽。     

内江猪γ干扰素基因的克隆、序列分析及真核表达载体的构建

将内江猪的外周血淋巴细胞在刀豆素（ConA）的刺激下培养24 h后，提取总RNA,应用一步法RT-PCR扩增γ干扰素（IFN-γ）cDNA,克隆到PMD18-T载体，命名为pMD-N-IFN-γ，测序结果证明克隆的cDNA全长603 bp，其ORF为501 bp，编码166个氨基酸，与Genbank公布的IFN-γ比对，核苷酸同源性在99.4%以上，从而证实成功地克隆了内江猪IFN-γ基因。以pMD-N-IFN-γ质粒为模板亚克隆完整ORF区,连接到真核表达质粒pcDNA3.1(+)的EcoRI、XhoI两位点之间，经单双酶切鉴定，成功的构建了IFN-γ真核表达载体pcDNA3.1(+)-N-IFN-γs。