甘蔗线条花叶病毒P1蛋白基因原核表达及抗血清制备

甘蔗线条花叶病毒Sugarcane streak mosaic virus(SCSMV)是引起甘蔗花叶病的主要病原之一,在世界各大蔗区普遍发生,严重威胁甘蔗产业的发展.建立快速有效的检测方法对于SCSMV的防控有着重要意义.本研究依据SCSMV P1基因序列合成一对引物,扩增获得1 074 bp的目的基因,将目的基因与...     

鸡抗REV血清的制备与检定

用网状内皮组织增生症病毒（REV）HA9901株免疫SPF鸡,无菌采血制备鸡抗REV血清。通过ELISA、IFA、AGP、HI等方法对制备的血清进行检测,未检出禽类常见的其他17种（或亚型）病毒的抗体,该血清具有良好的特异性。通过测定,该血清用于间接免疫荧光试验（IFA）的效价为1：2000,用于IFA检测REV的染色效果与REV单抗（11818和11854的混合物）相当。试验结果表明,该批血清1000倍稀释可作为一抗,用于REV的间接免疫荧光检测。     

小鼠H-Y单克隆抗体ELISA检测方法的建立

以纯系 BAL B/ c雄性小鼠脾细胞腹腔注射免疫同系雌性小鼠 9次 ,获得的抗血清经雌、雄鼠脾细胞吸收后用于精子细胞毒性试验 ,测得 H- Y抗血清效价为 1/ 16 0。选取免疫应答最好的雌鼠脾细胞与 SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,用精子细胞毒性方法筛选效价较高的细胞株制备腹水 ,建立优化的 EL ISA反应条件。优化后的 EL ISA反应条件为 :抗原4℃过夜 ,加 H- Y抗血清 37℃反应 12 0 m in,加 HRP- Ig G 37℃反应 30 min,加 TMB 2 5℃ 30 min。优化后的 EL ISA与常规 EL ISA比较 ,可以明显降低阴性吸光值 ,检测灵敏度从 1/ 32 0上升为 1/ 12 80     

多羟基双萘醛(WCT)抗血清的制备与不同酶联免疫吸附检测法的对比试验

通过对多羟基双萘醛分子式上的醛基的改造,利用混合酸酐法使小分子化合物多羟基双萘醛能够与大分子蛋白质BSA相结合,形成人工抗原,注射兔子,成功制备WCT抗血清。通过ELISA检测,血清的效价为1∶256,非专化性效价为1∶2。本试验比较了酶联夹心法和间接酶联法的灵敏度,发现间接法检测WCT的灵敏度比夹心法相对高,这为应用间接法检测WCT提供了依据。     

西瓜花叶病毒抗血清制备及其应用

 西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)是危害葫芦科作物的重要病毒。制备特异性强、效价高的抗血清对快速准确检测和鉴定WMV具有重要意义。本研究将WMV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV获得pEHISTEV-WMV-CP。将pEHISTEV-WMV-CP转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,成功表达出分子量约为36 kDa的蛋白,与预期WMV CP大小一致。切胶回收WMV CP,与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫健康新西兰大白兔。Western blotting结果表明,制备的抗血清与WMV CP有反应,与同属的番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)和烟草花叶病毒属的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)均无反应。酶联免疫吸附测定(PTA-ELISA)结果表明,本研究制备的WMV抗血清效价为1∶8 192,并且能够检测稀释512倍的病毒汁液。利用该抗血清对田间采集的10个RT-PCR检测为阳性的样品进行检测,全部呈现阳性。本研究利用大肠杆菌表达的CP制备的WMV抗血清具有较高的特异性和灵敏度。研究结果为WMV的快速检测和鉴定奠定了基础。     

草甘膦人工抗原合成及鼠源多抗血清制备

为检测小分子农药草甘膦(PMG)的残留,本研究合成草甘膦[N-(Phosphonomethyl)glycine PMG]人工抗原,通过免疫制备高敏感性、特异性的鼠源PMG多克隆抗血清;采用EDC法将PMG分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成免疫原PMG-BSA和包被原PMG-OVA;经紫外扫描、SDS-PAGE电泳、质谱鉴定后,免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清;利用间接ELISA法测定多抗血清效价,竞争ELISA测定多抗血清的敏感性和特异性。结果表明,所合成的免疫抗原效果较好,免疫的4只小鼠效价均达1∶104以上,4号小鼠的多抗血清敏感性最高,半数抑制浓度IC50为31.4μg·m L-1,与其他有机磷类农药无交叉反应,具备良好的特异性。本试验成功合成了PMG人工抗原,并制得了敏感性高、特异性好的鼠源多抗血清,为PMG单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

人、牛和羊叠朊基因的表达及牛叠朊蛋白抗血清的制备

叠朊（Dpl）是朊蛋白（PrP）的横向同源物,两者的功能密切相关。本研究旨在制备能够特异检测重组表达的或者动物组织中Dpl的抗血清,以用于研究Dpl的功能及其与PrP的关系。根据已克隆的汉族人、中国黄牛、甘肃土种羊的Dpl基因,将其Dpl成熟蛋白编码区分别定向克隆到表达载体pET-30a（4-）上,将重组表达载体转入E.coli BL21（DE3）pLys S,IPTG诱导表达。将表达并纯化的牛重组Dpl免疫4只青紫蓝兔,制备牛Dpl的抗血清,SDS—PAGE分析表明人、牛和羊的重组Dpl在E．coli中获得了高效表达。用Ni—NTA树脂亲和层析和胶洗脱法纯化了上述表达产物,ELISA和West—blot分析表明,制备的牛Dpl抗血清与重组人、牛和羊的Dpl以及牛和羊睾丸组织的Dpl发生了特异性反应,却不与重组人、牛和羊的PrP发生反应。上述结果表明制备的Dpl抗血清可以作为人、牛和羊Dpl的检测试剂和研究材料。     

苹果褪绿叶斑病毒PBM1毒株的提纯,抗血清制备研究总结

从木本植物上分离出的苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus)的PBM_1毒株能引起李品种“Hauszwetshe”的假痘病症状,将该毒株接种到昆诺藜上繁殖,感染PBM_1毒株的昆诺藜叶片用两次冻融蔗糖梯度离心提纯,每100g叶片的病毒含量平均为1.68mg。提纯的病毒溶液在电镜下可以观察到弯曲状病毒颗粒上的螺纹结构。通过SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,该病毒外壳蛋白的分子量21.5道尔顿。提纯的病毒免疫家兔制备的抗血清,用ELISA法检测感染PBM_1的昆诺藜叶片和桃花,检测效果很灵敏。     

嗜水气单胞菌J-1株OmpA融合蛋白的高效表达及免疫原性分析

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a（＋）中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93．1％-95％之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经诱导可表达分子量约57．4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50％以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清进行Western blot,在57．4kD处有明显反应条带。融合蛋白经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1：12800以上。Western blot检测结果显示,该血清与9株具有代表性的气单胞菌的分子量约35kD的外膜蛋白均有较强反应,说明所表达的融合蛋白不仅保持原有外膜蛋白的免疫原性,而且提示OmpA可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。[中国水产科学,2008,15（2）：301—306]